. Santé - Bu iş Doğa Bilimleri ve Kanada Kim Gilbert Mühendislik Araştırma Konseyi bir hibe ile desteklenen Fonds de la recherche du Québec bir öğrencilik tutar.

Hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi İlkelerine uygun olarak, yerel Hayvan Bakım Komitesi yönetmeliğine uygun olarak ele alınır. Sıçanlar, (21-22 ºC sıcaklık ve% 40-50 nem) ayrı ayrı sabit koşullarda muhafaza edilir 08:00 am başlayan, 12 saat karanlık-aydınlık döngüsünün dahil. Chow pelet ve musluk suyu çalışma boyunca ad libitum. Tedarikçi tarafından doğum sonrası 3 günlük bir alışma dönemi deney öncesi izin verilir. 300-800 g arasında olan erkek Sprague-Dawley sıçanları rutin olarak bu protokol ile kullanılmıştır. 1. MI Cerrahisi <ol><li> Ketamin 60 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg karın içinden enjeksiyonu ile anestezi neden. Pençeleri sıkışmak zaman refleksinin yokluğu ile doğru anesthetization onaylayın. </li><li> Cerrahi siteyi Tıraş. (16G 1.77 inç) kateter ve lateral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin: endotrakeal tüp ile entübe sıçan. Sıcaklık yaklaşık 37 ° C tutmak için bir ısıtma pedi üzerine hayvanlar koyun. % 2 izofluran endotrakeal tüp bağlayın. </li><li> Klorheksidin glukonat ve izopropil alkol ile cerrahi siteyi hazırlayın. Ameliyat sırasında steril eldiven ve steril aletler kullanın. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için her iki göze oftalmik merhem sürün. Hayvan ve hayvan yanındaki başka bir steril alanında araçlara steril alan yerleştirin. </li><li> Neşter bıçak # 10 ile cildi İnsizyon. Hemostatik kelepçe ile kas dokusu soyulabilir. Ventral dekübit pozisyonunda hayvan yerleştirin. Hemostatik kelepçe ve pozisyon göğüs Retraktörü Açık göğüs duvarı. Hemostatik kelepçe ile Açık perikard. </li><li> Bitişik miyokard dokusu geçerek, koroner oklüzyon, döngü inen koroner arterin etrafında 360 mm uzunluğunda 4-0 ipek sütür üretmek. Bir 14G, 1,25 cm uzunluğunda plastik tüp içine ipek sütür her iki ucunu yerleştirin. </li><li> Ipek sütür ve irin iki ucunu çekinh aşağı arterin karşı tüp 40 dakika, bunu tıkanması için. Bir hemostatik kelepçe ile plastik tüp sıkma ile Güvenli tıkanıklığı. </li><li> 40 dakika sonra, esnek boru ve ipek dikiş çıkarılarak hazırlanabilir hemostatik kelepçe, serbest tarafından oklüzyonu bırakın. Not: Sham kontrol fareler aynı cerrahi prosedür eksi koroner arter tıkanıklığı uğrarlar. </li><li> Torasik duvar kapatmadan önce, pnömotoraks önlemek için 5 ml şırınga ile toraks havayı dışarı çekmek için göğüs boşluğundan esnek bir kateter (18G, 4.5 cm) yerleştirin. </li><li> Kapat toraks boşluğu 2-0 sütür ile, 4-0 ipek sütür ile kas ve 3-0 ipek sütür ile cilt dikiş. </li><li> Geçen cilt noktasını kapatmadan önce, yine göğüs boşluğuna önce yerleştirilmiş kateter ile 5 ml şırınga ile toraks havayı çizin. </li><li> Geçen cilt noktasını dikin. Izofluran havalandırma durdurun. </li><li> Sıçan uyanış izleyin. O Regaine olana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınd yeterli bilinç sternum yatma korumak için. </li><li> Bir antibiyotik ile bir analjezik (buprenorfin, 0,05 mg / kg ip) ile 24 saat (duplocillin tek bir dozu, 0.2 mg / kg ip) için sıçana her 8 saat tedavi edin. </li><li> Ameliyattan sonra, ev fareleri tek tek, yani kurban zamanına kadar, 3 gün sonrası MI. </li><li> Enfarktüs büyüklüğü, özellikle nekroz sol ventrikülün risk altındaki alanlarda bulunan enfarktlı doku oranı olarak ifade edilir. Bu trifeniltetrazolyum renklenme 11 kullanılarak ölçülür olabilir. </li></ol> 2. Amygdala İzolasyon <ol><li> Onun burnu dar olan uç açıklığı dışarı çıkıntılı, bir koni şeklinde çanta içinde ilk hayvan kafası yerleştirin. Güvenli sıçan herhangi bir hareketi önlemek için. Makas bıçakları arasında, giyotin üzerinde uygun başını yerleştirin. Hayvan başını kesmek. </li><li> Bir tabak sıçan Yeri başkanı ezilmiş buz tuttu. Ezilmiş buz (4 ° C) doku olarak ayırma işlemleri gerçekleştirir. </li><li> Cut açık skull makasla dikkatlice yukarı çekerek ve altındaki dokuyu yaralama kaçınarak kemik rongeurs kemik kılıfları ayırmak. </li><li> Kafatasının alt ve beynin posterior ventral yüzeyi arasında bir spatula düz bıçağı yerleştirin ve dikkatlice beyin yavaşça dışarı kaldırdı olabilir kadar yavaşça kafatasının alt kısmı boyunca ileriye doğru bıçağı iterek kafatası beyin ayırmak kafatası. Kafatası atın. </li><li> Dorsal yüzeyinde beyin yerleştirin. Hipotalamus (beyincik önünde yapısını) tanımlamak ve ön ucu ve arka ucu önünde ve arkasında koronale beyin kesmek; diğer kullanımlar için gerekli değilse beynin ön ve arka bölümlerini atmak. </li><li> Hemen yanında hipotalamus, bilateral, temporal lob altında küçük küreler olarak amygdalas gözünüzde canlandırın. </li><li> Uzakta deneyci gelen, onun ön ucundaki dorsal yüzeyini beyin düz çevirin. </li><li> Beynin sol veya sağ tarafı ile başlayın. Hemi ayırınDaha sonra küreler ve mücavir amigdala gelen korteks. Amigdala izolasyonunu sağlamak için bu gevşek korteksin yolu yaklaşık 8 mm kesin. Neşter ile amigdala kesip. </li><li> Karşıya çalışan karanlık sütür, neredeyse yarı yarıya boyunca keserek kendi centromedial kısmından amigdala bazolateral kısmını ayırın. Bu yapı her zaman kolayca tanımlanabilir değildir. </li><li> Ayrı tespit şişelerde amigdala alt parçalarının koyun ve ezilmiş buz üzerinde tutmak. </li><li> Diğer yarımkürede ile tekrarlayın diseksiyon prosedürü. </li><li> 1 dakika süre ile sıvı azot içinde şişeleri bırakın. Ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C dondurucu içinde flakonu tutun. </li></ol> 3. Kaspaz-3 Aktivite <ol><li> Sukroz 0.32 M,% 1 Triton-X-100, Tris-HCI, pH 8, etilendiamintetraasetik asit 5 mM, ditiyotreitol 2 mM, fenilmetilsülfonil fluorür, 1 mM, leupeptin, 10 ug / ul 10 mM liziz tamponu , pepstatin A 10 mg / ml aprotinin, 10 ug / ml. </li><li>Her numune (5-10 mg), lizis tamponu 150 ul ekle. Buz üzerinde tutun. Maksimal şiddette (40 W) 5 saniye boyunca buz üzerinde her örnek sonikasyon. 30 dakika boyunca buz üzerinde liziz tamponunda doku inkübe edin. Vorteks 5 dakika boyunca her bir numune. </li><li> Alternatif olarak sıvı azot içinde ve 37 ° C&#39;de ayarlanmış bir termostatik olarak kontrol edilen ısıtma plakası üzerinde numuneler yerleştirilerek 3 donma / çözülme devrelerine gerçekleştirin. 13.000 g Santrifüj doku (4 10 dakika boyunca ° C). Dikkatle süpernatant kaldırmak ve buz üzerinde tüp içinde tutmak. </li><li> Büyükbaş hayvan serum albümini ile 0 ve 10 ug / ml arasında, standart protein konsantrasyonları hazırlayın. Sadece tampon maddesi ile boşlukları hazırlayın. </li><li> Her standart Bradford reaktifi 200 ul ekle. 595 nm standart okuyun. Protein seviyeleri için, damıtılmış su içinde 795 | il Bradford reaktifi 200 ul numune süpernatan 5 ul ekleyin. 595 nm&#39;de her bir örnek okuma ve standart eğri ile protein miktarı belirlenir. </li><li> 5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCI, pH 7, &lt;reaksiyon tamponu hazırlayın/ sub&gt;, etilen glikol tetraasetik asit, 1 mM, 3-kolamidopropil% 0.1) dimetilamonyo] -1-propansülfonat ve ditiotreitol, 1 mM. </li><li> Pozitif ve negatif reaktif örnekleri elde etmek reaksiyon tamponu ve kaspaz-3 yüzeylerde proteinin 25 ug ekleyin. Negatif numuneler için, proteinin 25 ug, Ac-DEVD-CHO 800 uM 0.4 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul reaksiyon tamponu ilave edin. Pozitif örnekler için, reaksiyon tamponu proteinin 25 ug ve Ac-DEVD-AMC 10 mM 0,8 ul ekle. Üç nüsha halinde tüm negatif ve pozitif örnekleri işleyin. Reaksiyon tamponu ilave edilerek 200 ul kadar Her numunenin son hacim tamamlanması. </li><li> Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0.5 ul, 0.8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM liziz tamponu 10 ul reaksiyon tampon maddesi 188,7 ul ekleyerek negatif kontrolleri üretir. Pozitif kontroller için, reaksiyon tamponu 189.2 ul, Ac-DEVD-AMC 10 mM, 0.8 ul lizis tamponu 10 ul ekle. </li><li> Örnekleri inkübe ve37 O ° C&#39;de 3 saat süreyle karanlıkta kontroller </li><li> Her bir numune ve kontrol 600 ul 0.4 M glisin ve NaOH 0.4 M (pH 10) ile reaksiyonu durdurun. </li><li> 465 nm, 365 nm ve emisyon dalga uyarma dalga boyunda spectrofluorometry ile floresan ölçmek. Bir cam küvet içinde reaksiyona damıtık su 2 ml ilave edilir. Her saniyede 1 puan 10 saniye boyunca kontrolleri ve numuneleri okuyun. </li><li> Her bir örnekte spesifik aktivitesi niceliğini: ((negatif numuneler eksi pozitif örneklerin floresan) 2,8 ml x hacim floresan) (Protein 25 mg inkübasyon 3 saat x miktarı zaman) bölünmesidir. </li></ol>

<ol>
	<li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+keys+in+the+ignition+of+cell+death.">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li><li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors:+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway.">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala.">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li><li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li><li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model.">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li><li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression.">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li><li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Killing+the+blues':+a+role+for+cellular+suicide+(apoptosis)+in+depression+and+the+antidepressant+response.">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways:+paper+wraps+stone+blunts+scissors.">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Son 10 yılda bu protokol ile Deneyimlerimiz kritik metodolojik konular belirlenmesine yol açmıştır. İlk olarak, kırılmış buz üzerine bir petri çanağına hızlı beyin diseksiyon hazırlanması kalitesini muhafaza etmek önemlidir. İkinci olarak, doku sonication, diğer kalp (10 saniye) ve dokuların türleri veya böbreklerin (20 saniye) ile karşılaştırıldığında, serebral amigdala daha kısa olduğunu fark edilmelidir. Üçüncü olarak, büyük bir özenle dikkatle örnekleri eklemeden önce alt tabakayı karıştırmak için alınmalıdır. Karıştırma dizisi yetersiz Biz ne zaman değişken sinyaller karşılaştık. Örnekleri okurken Dördüncü olarak, kabarcıklar, kuvars hücrede mevcut olması gerekmektedir. Aksi takdirde, bir sinyal değiştirilebilir. 1 ul daha az hacim önlemek için alt tabaka hacminin artırılması: Biz sonuçların tekrarlanabilirliği artırmak için son yıllarda bir değişiklik yaptı. Yine, küçük varyasyonları izleyen tahliller arasında meydana gelebilecek, ve en az 3 kontrol numuneleri için kullanılmalıdırvaryasyonlar için kontrolü. Bu kontrollerin Floresan tedbirleri ortalaması alınır ve ortalama% 100 olarak belirlenmiştir. Deneysel örneklerde Floresan tedbirleri kontrol numunelerinin yüzde dönüşür. Tekniğin bir başka sınırlama, bu nedenle kaspaz-3 aktivitesi göz ardı edilebilir, doku sadece bir kısmı kullanıldığı ve. Nitekim, apoptoz zaman penceresi herhangi bir hücrede kısa ve 1,4,15 örnekleme sırasında komşu bölgelerde oluşuyor olsa bile kaçırmış. Bunun tam tersi de mümkündür: apoptoz kaspaz-3 aktivitesi olduğundan fazla tahmin sonuçlanan doku bölümleri, özellikle yoğun olabilir. Biz böyle TÜNEL deneyleri veya Bax / Bcl2 oranı (bkz) gibi tamamlayıcı teknikler, kalan dokuların (amigdala) kullanmanızı tavsiye ederiz. Spectrofluorometry Western blot üzerinde, en azından iki avantajı vardır. Birincisi, doğrudan nicel veri üretir. İkincisi, bu enzimatik a ölçerctivity kendisi yerine ilgisiz olabilir, ve protein ifadesi enzimatik etkinlikteki herhangi bir değişiklik olmadan arttırılabilir bilinmektedir proteini veya RNA ekspresyon. Ayrıca, spectrofluorometry diğer dokularda veya farklı hayvan türleri ile yapılabilir ve farklı alt-tabakalar ile ve diğer kaspaz alt-tipleri için ayarlanabilir, böylece güvenli bir karşılaştırma yapılabilir. Sonuç olarak, bu belgenin o apoptoz 3 gün MI sonrası limbik sistemin bu bölgede meydana kanıt sağlama, amigdala kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için spectrofluorometry kullanımını gösterir.

Kaspazlar ya Sistein bağımlı aspartat yönelik proteazlar çeşitli homeostazı süreçlerini 1 katılan bir enzim ailesidir. Kaspazlar geniş apoptosis veya inflamasyon kendi rollerine göre sınıflandırılabilir. Kaspaz-1, -4, -5 ve -12 apoptosis uğraşanların olabilir oysa inflamasyon katılan alt sınıflandırılmış başlatıcı kaspazlara olarak (kaspaz-8 ve -9) ve cellat kaspazlar (kaspaz-3, -6 -7 ve ). Miyokard enfarktüsü (MI) veya serebral iskeminin ardından gözlemlenen Kaspazlar, esas olarak apoptoz fazla olabilir hastalıklarda çok patolojilerin önemli rol oynar. Bizim laboratuvarda kullanılan post-MI sendromunun sıçan modelinde, bu kaspaz-3 miyokardın 2 değil, aynı zamanda ruh ve duyguların 3-6 kontrolünde karıştığı limbik sistemde sadece etkin olduğunu kurulmuştur. Ayrıca, kaspaz-3, farklı bölgelerde aktif olduğu görülmektedirlimbik sistemin, bu tür amigdala ve hipokampus ve iskemik hakaret 4 sonra 3 gün etrafında bu aktivasyon zirveleri olarak. İlginçtir, kaspaz-3 aktivitesi post-MI davranış bozuklukları ile ilişkilidir ve farmakolojik ve beslenme müdahaleler yoluyla zayıflama kaspaz-3 ve post-MI depresyon 7-12 arasındaki olası bağlantıyı düşündüren, bu yaralanmaları azaltır. Kaspaz-3 aktivasyonu, çeşitli teknikler ile ölçülebilir. Western blotting kaspaz enzimatik özellikleri tespit eder ve aktif enzimler olarak pro-enzim biçimleri algılayabilir. Western lekeleme, ancak yarı-kantitatif ve küçük varyasyonlar, zayıf sinyal-ses oranlarına 13 ile kaybolabilir. Daha iyi bir teknik, bir florojenik bileşiği serbest bırakır ve spectrofluorometry ölçülebilir kaspaz-3, bir alt-tabaka (DEVD-AMC) bölünmesine dayanmaktadır. Kaspaz-3 aktivasyon apoptoz güvenilir bir göstergesidir. Apoptoz ca ölçümün oluşma zaman penceresi kısa olduğu için kararsız ve komşu hücrelerin apoptotik organları veya hücreleri 14 fagosite olabilir. Apoptosis ayrıca, Bax / olarak apoptotik sinyal silsileleri 6, ya da anti-apoptotik / pro protein oranı, elde edilen DNA parçalanmasını algıladığı, örneğin terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç işaretleme analizi (TÜNEL) deneyi gibi diğer teknikler tarafından teyit edilebilir Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

Miyokard infarktüsü (Mİ) fizyolojik ve davranışsal düzeyde dramatik orta ve uzun vadeli sonuçları vardır, ancak ilgili mekanizmalar hala belirsizdir. Laboratuvarımız bozulmuş kardiyak fonksiyonları, limbik sistemde nöronal kayıp, bilişsel açıkları ve depresyon belirtileri gösterir davranışsal post-MI sendromu sıçan modeli geliştirmiştir. Post-MI 3 gün zirve - nöronal düzeyde, kaspaz-3 aktivasyonu gibi amigdala gibi farklı limbik bölgelerde, post-MI apoptozu aracılık eder. Bilişsel ve davranışsal bozukluklar 2-3 haftalar sonrası MI görünür ve bu kaspaz-3 aktivitesi önlemleri ile istatistiksel korelasyon. Burada açıklanan protokol, MI neden amigdala doku toplamak ve spectrofluorometry kullanarak kaspaz-3 aktivitesini ölçmek için kullanılır. MI teşvik etmek için, inen koroner arter 40 dakika tıkanır. Sıçanlar kurban edilir ve amigdala rapi izole: kaspaz-3 aktivasyonu değerlendirilmesi için protokol 3 gün MI sonra başlarbeyin GEC. Numuneler hızlı bir şekilde sıvı azot içinde donduruldu ve gerçek analiz kadar -80 ° C&#39;de tutulur. Kaspaz-3 aktivasyonunu değerlendirmek için tekniklerin spectrofluorometry ile ölçülebilir bir flüorojenik bileşiği serbest kaspaz-3, bir alt-tabaka (DEVD-AMC) bölünmesine dayanmaktadır. Yöntem niceliksel ve tekrarlanabilir ama gerektiren ekipman pahalıdır ve numune ölçülmesi için prosedür, zaman alıcıdır. Bu teknik, kalp ve böbrek gibi diğer dokuların, tatbik edilebilir. DEVD-AMC için diğer kaspaz aktivitesini ölçmek için diğer substratlar ile ikame edilmiş olabilir.

Amigdala 8 sham (kontrol) ve üç gün iskemi / reperfüzyon protokolü indüksiyonundan sonra 8 MI sıçanlarda izole edildi. Kaspaz-3 aktivitesi, aktif kaspaz-3 ile ayrıldı ve spectrofluorometry ile tespit edilebilir bir florokrom ile bu dokuda ölçülmüştür. Pozitif ve negatif ölçümler (adımları 3.11, 3.12 ve 3.16 bakınız) her saniyede 1 puan, 10 saniye boyunca üç nüsha olarak gerçekleştirilen ve ölçüldü. Pozitif ve negatif kontroller arasındaki fark hesaplanır ve bu deney sırasında gerçekleştirilen tüm sahte doku farkların ortalaması% 100 olarak ayarlandı. MI sıçanlardan sonuçları bu referansa göre ölçeklenmiştir ve Şekil 1 nihai sonuçları göstermektedir: bu sham (p &lt;0.05) ile karşılaştırıldığında MI farelerde önemli ölçüde daha yüksek etkin olduğunu gösterir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Şekil 1. Kaspaz-3MI sıçanların amigdala aktivite,% 100 (grup başına 8 sıçan) olarak ayarlanır, sahte kontrol grubunda ortalama aktivite yüzdesi olarak ifade edilir. * Anlamlı gruplar arası fark (p &lt;0.05) gösterir. Veri, ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction at JoVE.com

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Görüntüleme.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Video: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Sıçanlarda Akut Miyokard Enfarktüsü

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Tıp

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biyokimya

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Sıçanlar Kronik Kalp Enfarktüsü histolojik Niceleme

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Sol Anterior İnen Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile Murine Miyokard Enfarktüsü Modeli

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

<meta charset="utf8"></head><body>Sıçanlarda Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeni Bir Kalp Yetmezliği Modeli

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Sıçanlarda Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeni Bir Kalp Yetmezliği Modeli

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Bozulmamış Bir Perikard İskemik Kemirgen Modeli

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

<meta charset="utf8"></head><body>Nakavt farelerde kardiyak onarım ve yeniden şekillenmeyi incelemek için deneysel bir miyokard enfarktüsü modeli

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Nakavt farelerde kardiyak onarım ve yeniden şekillenmeyi incelemek için deneysel bir miyokard enfarktüsü modeli

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Miyokard İnfarktüsü Sonrası Spectrofluorometry tarafından ölçülen Sıçan amigdala kaspaz-3 Etkinlik

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Sıçanlarda Akut Miyokard Enfarktüsü

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Sıçanlar Kronik Kalp Enfarktüsü histolojik Niceleme

Sol Anterior İnen Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile Murine Miyokard Enfarktüsü Modeli

Sıçanlarda Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeni Bir Kalp Yetmezliği Modeli

Sıçanlarda Miyokard Enfarktüsü Sonrası Yeni Bir Kalp Yetmezliği Modeli

Bozulmamış Bir Perikard İskemik Kemirgen Modeli

Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Bir Sıçan İskemi/Reperfüzyon Modelinde Kardiyak Mikrovasküler Endotel Bariyerinin Geçirgenliğini Değerlendirmek İçin Bir Floresan Testi

Nakavt farelerde kardiyak onarım ve yeniden şekillenmeyi incelemek için deneysel bir miyokard enfarktüsü modeli