. עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה קים גילברט מחזיק מלגת לימודים מחטיבות דה לה משוכלל ונדיר du קוויבק - סנטה.

בעלי חיים מטופלים בעמידה ברגולציה של ועדת הטיפול בבעלי חיים המקומית, בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. חולדות שוכנו בנפרד בתנאים קבועים (טמפרטורה של 21-22 מעלות צלזיוס ולחות של 40-50%), כולל מחזור כהה אור 12 שעות, מתחיל בשעה 08:00 בבוקר. כדורי צ&#39;או ומים ברז הם כרצונך מודעה זמין לאורך כל תקופת המחקר. תקופת התאקלמות של 3 ימים לאחר לידה על ידי הספק מותר לפני הניסוי. חולדות זכרי Sprague-Dawley משקל בין 300-800 גר היו בשימוש באופן שיגרתי עם פרוטוקול זה. 1. ניתוח MI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה עם זריקות intraperitoneal של 60 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine. אשר הרדמה תקינה על ידי היעדר רפלקס כאשר כפות הם צבטו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח אתר כירורגית. צנרר עכברוש עם צינורות endotracheal: צנתר (16G 1.77 אינץ &#39;) ולמקם את החיה בעמדת פַּחֶסֶת רוחב. מניחים את בעלי החיים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורה סביב 37 מעלות צלזיוס. חבר את צינורות endotracheal לIsoflurane 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אתר כירורגית עם gluconate chlorhexidine ואלכוהול איזופרופיל. במהלך ניתוח, להשתמש בכפפות סטריליות ומכשירים מעוקרים. החל משחת עיניים לשני העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. שים שדה סטרילי על בעלי חיים ועל המכשירים אחר שדה סטרילי בסמוך לבעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את עור עם להב סכין מנתחים # 10. לקלף את רקמת שריר עם מהדק עוצר דמום. מניחים את החיה בעמדת פַּחֶסֶת הגחון. קיר בית חזה פתוח עם מפשק חזה מהדק ומיקום עוצר דמום. קרום הלב פתוח עם מהדק עוצר דמום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר חסימה כלילית, לולאת תפר משי 4-0 מ&quot;מ 360-ארוך סביב העורקים הכליליים יורדים, עובר דרך רקמת שריר לב רציפה. הכנס את שני הקצוות של תפר המשי ל14g, צינור פלסטיק ארוך 1.25 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את שני הקצוות של תפר המשי ומוגלהh הצינור נחלש כנגד העורק כדי לחסום אותו, במשך 40 דקות. חסימה מאובטחת על ידי הידוק צינור הפלסטיק עם מהדק עוצר דמום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 40 דקות, לשחרר את החסימה על ידי שחרור המהדק עוצר דמום, ואחריו הסרת תפר צינורות ומשי גמיש. הערה: חולדות שליטה שאם עוברות את אותו הליך כירורגי מינוס החסימה של העורקים הכליליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סגירת קיר בית החזה, מקום צנתר גמיש (18G, 4.5 סנטימטרים) בחלל בית החזה לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ&quot;ל כדי למנוע pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלל בית החזה לסגור עם 2-0 תפר, לתפור את השריר עם תפר 4-0 משי ועור עם 3-0 תפר משי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סגירת נקודת העור שעברה, שוב לצייר אוויר מבית החזה עם מזרק 5 מ&quot;ל באמצעות הצנתר ממוקם בעבר בחלל בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור נקודת עור שעברה. תפסיק אוורור isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התעוררות חולדה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד יש Regaineתודעה מספיק ד לשמור כיבתה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את חולדה כל שעה 8 לשעה 24 עם משכך כאבים (עצירות, 0.05 מ&quot;ג / IP קילוגרם) ועם אנטיביוטיקה (מנה אחת של duplocillin, 0.2 מ&quot;ג / IP קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, חולדות בית בנפרד עד זמן הקרבה, כלומר, 3 ימים לאחר אוטם לבבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל אוטם, בעיקר נמק, מתבטא בשיעור של רקמת אוטם שריר באזור בסיכון של החדר השמאלי. זה יכול נמדד באמצעות צבע triphenyltetrazolium 11. </li></ol> 2. בידוד האמיגדלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ראש החיה ראשונה בתיק בצורת חרוט, עם אפה הבולט מתוך צמצם הקצה הצר. עכברוש מאובטח כדי למנוע כל תנועה. מקם את ראשה כראוי על הגיליוטינה, בין להבי המספריים. לערוף חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מקום החולדה בצלחת כל הזמן על קרח כתוש. לבצע את כל ההליכים לבידוד רקמות על קרח כתוש (4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SK הפתוח לחתוךull עם מספריים, לנתק בזהירות נדני עצם עם rongeurs עצם על ידי משיכת והימנעות פציעת הרקמה מתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להב השטוח של מרית בין החלק התחתון של הגולגולת ומשטח הגחון האחורי של המוח ולנתק בזהירות מוח מגולגולת על ידי דחיפה קלה של הלהב קדימה לאורך החלק התחתון של הגולגולת עד שהמוח יכול להיות הרים לאט מ גוּלגוֹלֶת. מחק את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מוח על פני השטח הגב שלה. לזהות ההיפותלמוס (מבנה בחזית של המוח הקטן) ולחתוך את מוח coronally מול הקצה הקדמי שלה ומאחורי הקצה האחורי שלה; השלך את החלקים הקדמי והאחוריים של המוח, אם אין צורך לשימושים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין amygdalas כמו כדורים קטנים מתחת האונה הטמפורלית, דו-צדדי, רק בסמוך להיפותלמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את שטוח המוח בסוף הקדמי שלה, משטח הגבי מהניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם צד שמאלי או ימני של המוח. הפרד את חמיתחומים ולאחר מכן הקליפה מהאמיגדלה רציפה. חותך דרך כ -8 מ&quot;מ של זה רופף קליפה כדי לאפשר בידוד של האמיגדלה. לחתוך אמיגדלה עם אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את החלק של basolateral האמיגדלה מחלק centromedial על ידי חיתוך לאורך התפר הכהה שחוצה אותו, כמעט חצי וחצי. מבנה זה לא תמיד קל לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים subparts האמיגדלה בבקבוקונים מזוהים נפרדים ולשמור על קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך נתיחה חוזר עם חצי הכדור האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הבקבוקונים בחנקן נוזלי דקות 1. שמור בקבוקון במקפיא -80 ° C עד צורך. </li></ol> 3. caspase-3 פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר תמוגה עם 0.32 M של סוכרוז, 1% Triton-X-100, 10 מ&quot;מ של טריס-HCl, pH 8, 5 מ&quot;מ של חומצת ethylenediaminetetraacetic, 2 מ&quot;מ של dithiothreitol, 1 מ&quot;מ של פלואוריד phenylmethylsulfonyl, 10 מיקרוגרם / μl של leupeptin , 10 מיקרוגרם / μl של pepstatin ו -10 מיקרוגרם / μl של aprotinin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">להוסיף 150 μl של חיץ תמוגה לכל דגימה (5-10 מ&quot;ג). שמור על קרח. Sonicate כל דגימה על קרח למשך 5 שניות בעוצמה מקסימלי (40 W). דגירה רקמה במאגר תמוגה על קרח למשך 30 דקות. וורטקס כל מדגם למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מחזורי 3 הקפאה / הפשרה על ידי הצבת דגימות לסירוגין בחנקן נוזלי ועל צלחת חימום תרמוסטטית שליטה המוגדרת על 37 מעלות צלזיוס. רקמת צנטריפוגה ב 13,000 ז (4 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות. מוציא בזהירות supernatant ולשמור בצינור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי חלבון סטנדרטיים בין 0 ל 10 מיקרוגרם / מיליליטר עם אלבומין בסרום שור. הכן את החסר עם חיץ בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מגיב ברדפורד לכל תקן. קראו סטנדרטי ב595 ננומטר. לרמות חלבון, להוסיף 5 μl של supernatant המדגם לμl 795 של מים מזוקקים ו -200 μl של מגיב ברדפורד. קראו כל דגימה ב595 ננומטר ולכמת חלבון עם עקומה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תגובה עם 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7, 5 מ&quot;מ של MgCl 2 &lt;/ Dimethylammonio] -1-propanesulfonate משנה&gt;, 1 מ&quot;מ של חומצת tetraacetic אתילן גליקול, 0.1% מ3-cholamidopropyl) ושל 1 מ&quot;מ dithiothreitol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מיקרוגרם של חלבון למצעי חיץ התגובה וcaspase-3 להשיג דגימות תגובה חיוביות ושליליות. עבור דגימות שליליות, להוסיף למאגר תגובה, 25 מיקרוגרם של חלבון, 0.4 μl של מיקרומטר Ac-DEVD-CHO 800 וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ. לדגימות חיוביות, להוסיף 25 מיקרוגרם של חלבון למאגר תגובה וμl 0.8 של Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ. לעבד את כל הדגימות השליליות וחיוביות בשלושה עותקים. השלם את הנפח הסופי של כל דגימה עד 200 μl על ידי הוספת תגובת חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר בקרה שלילית על ידי הוספת 188.7 μl של חיץ תגובה ל 0.5 μl של Ac-DEVD-CHO 800 מיקרומטר, 0.8 μl Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. לבקרות חיוביות, להוסיף 189.2 μl של חיץ תגובה, 0.8 μl של Ac-DEVD-AMC 10 מ&quot;מ ו -10 μl של מאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ובקרות בחושך במשך 3 שעות על 37 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצות עם 600 גליצין μl 0.4 מ &#39;ו -0.4 NaOH M (pH 10) בכל דגימה ושליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת הקרינה על ידי spectrofluorometry בגל עירור של 365 ננומטר אורך גל ופליטה של ​​465 ננומטר. הוסף 2 מיליליטר של מים מזוקקים לתגובה בקובט זכוכית. קראו בקרות ודגימות למשך 10 שניות עם נקודה 1 בכל שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת פעילות ספציפית בכל דגימה: ((הקרינה של דגימות שליליות מינוס הקרינה של דגימות חיוביות) x נפח של 2.8 מיליליטר) מחולקים ב( זמן דגירה 3 כמות x שעות של חלבון 25 מ&quot;ג). </li></ol>

<ol>
	<li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+keys+in+the+ignition+of+cell+death.">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li><li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors:+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway.">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala.">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li><li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li><li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model.">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li><li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression.">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li><li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Killing+the+blues':+a+role+for+cellular+suicide+(apoptosis)+in+depression+and+the+antidepressant+response.">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways:+paper+wraps+stone+blunts+scissors.">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הניסיון שלנו עם פרוטוקול זה מעל 10 השנים האחרונות הוביל לזיהוי של בעיות מתודולוגיות קריטיות. ראשית, לנתיחה מוח מהירה בצלחת פטרי על קרח כתוש חשוב לשמור על איכות הכנה. שנית, הוא חייב להיות הבין שsonication רקמה קצר לאמיגדלה המוחית בהשוואה לסוגים אחרים של רקמות, כמו הלב (10 שניות) או כליות (20 שניות). שלישית, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לערבב בזהירות את המצע לפני הוספתו לדגימות. נתקלנו אותות משתנים כאשר רצף הערבוב היה לקוי. רביעית, אין בועות צריכה להיות נוכחת בתא קוורץ בעת קריאת הדגימות. אחרת, את האות אפשר לשנות. אנחנו עשינו שינוי בשנים האחרונות להגדיל את שחזור של התוצאות: הגדלת נפח מצע, כדי למנוע נפח של פחות מ 1 μl. ובכל זאת, שינויים קטנים עשויים להתרחש בין מבחני רצופים, ויש להשתמש לפחות 3 דגימות בקרה לשליטה לווריאציות. צעדי הקרינה של בקרות אלה בממוצע והממוצע מוגדר ב 100%. צעדי הקרינה בדגימות ניסוי הופכים באחוזים של דגימות הבקרה. מגבלה נוספת של הטכניקה היא שרק חלק מהרקמה משמש, ולכן, caspase-3 פעילות יכולה לזלזל. ואכן, החלון של אפופטוזיס הזמן קצר בכל תא נתון ויכול להיות שלא נענו למרות שהיא מתרחשת באזורים הסמוכות בזמן דגימת 1,4,15. ההפך הוא גם אפשרי: אפופטוזיס יכול להיות אינטנסיבי במיוחד בחלקים של רקמה, וכתוצאה מכך הערכת יתר של caspase-3 פעילות. אנו ממליצים על השימוש ברקמות שנותרו (אמיגדלה) לטכניקות משלימות, כגון מבחני TUNEL או יחס Bax / Bcl2 (ראה מבוא). יש Spectrofluorometry לפחות שני יתרונות על פני מערבי סופג. ראשית, אותו ישירות מייצר נתונים כמותיים. שנית, הוא מודד האנזימטיתctivity עצמו ולא חלבון או RNA ביטוי, אשר עשוי להיות קשורים, וזה ידוע כי ביטוי חלבון עשוי להיות מוגבר ללא כל שינוי בפעילות האנזימטית. יתר על כן, spectrofluorometry יכול להתבצע על רקמות אחרות או עם בעלי חיים שונים ויכולה להיות מותאם לתת caspase אחרים, עם מצעים שונים, כך ניתן לבצע השוואות שבטוחות. לסיכום, מסמך זה מדגים את השימוש בspectrofluorometry למדוד caspase-3 פעילות באמיגדלה, מתן עדות אפופטוזיס המתרחש באזור זה של המערכת הלימבית 3 ימים לאחר אוטם לבבי.

Caspases או פרוטאזות המכוונת aspartate ציסטאין תלוי היא משפחה של אנזימים שמעורבים בprocessess הומאוסטזיס שונים 1. Caspases יכול להיות מסווג באופן כללי על פי תפקידיהם באפופטוזיס או דלקת. Caspase-1, -4, -5 ו-12 מעורבים בדלקת ואילו אלה העוסקים באפופטוזיס יכולים להיות תת-מסווג כcaspases יוזם (caspase-8 ו -9) וcaspases התליין (caspase-3, -6 ו-7 ). Caspases לשחק תפקידים משמעותיים בפתולוגיות רבות, בעיקר בהפרעות בי אפופטוזיס יכול להיות מוגזם, כפי שנצפה לאחר אוטם שריר לב (MI) או איסכמיה מוחית. במודל העכברים של תסמונת הפוסט-MI משמשת במעבדה שלנו, נקבע כי caspase-3 מופעל לא רק בשריר הלב 2, אלא גם במערכת הלימבית שמעורבת בשליטה על מצב רוח ורגשות 3-6. הוא גם ראה שcaspase-3 מופעל באזורים שוניםשל המערכת הלימבית, כגון האמיגדלה וההיפוקמפוס, ופסגות הפעלה זה סביב 3 ימים לאחר עלבון איסכמי 4. מעניין לציין, caspase-3 פעילות בקורלציה עם ליקויים התנהגותיים לאחר אוטם לבבי, וההנחתה שלה באמצעות התערבות תרופתית ותזונתית מפחיתה פציעות אלה, המצביע על קשר אפשרי בין caspase-3 ודיכאון לאחר אוטם לבבי 7-12. Caspase-3 הפעלה ניתן למדוד על ידי טכניקות שונות. מערבי סופג ascertains המאפיינים האנזימטית של caspases ויכול לזהות אנזימים פעילים, כמו גם צורות פרו-האנזים שלהם. מערבי סופג, לעומת זאת, הוא חצי כמותית, ויכולים ללכת לאיבוד וריאציות קטנות באמצעות יחסי אות לרעש חלשים 13. טכניקה טובה יותר מבוססת על המחשוף של מצע (DEVD-AMC) על ידי caspase-3 שמשחרר מתחם fluorogenic וניתן למדוד על ידי spectrofluorometry. Caspase-3 הפעלה היא סמן אמין של אפופטוזיס. מדידה של CA אפופטוזיסn להיות לא יציב בגלל החלון של התרחשות הזמן קצר, ותאים שכנים יכולים phagocytize גופים או תאים אפופטוטיים 14. אפופטוזיס ניתן לאשר עוד יותר על ידי טכניקות אחרות, כגון תיוג סוף dUTP ניק assay מסוף deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), שמזהה פיצול ה- DNA וכתוצאה ממפלים אפופטוטיים איתות 6, או היחס של חלבונים פרו / אנטי-אפופטוטיים, כגון Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

אוטם שריר לב (MI) יש השלכות אמצע וארוך טווח דרמטיים ברמות הפיזיולוגיות והתנהגותיים, אך המנגנונים המעורבים עדיין אינם ברורים. המעבדה שלנו פיתחה מודל חולדה של תסמונת הפוסט-MI המציגה פונקציות לקויים של הלב, אובדן עצבי במערכת הלימבית, ליקויים קוגניטיביים וסימנים התנהגותיים של דיכאון. ברמה העצבית, caspase-3 הפעלה מתווכת אפופטוזיס לאחר האוטם הלבבי באזורים הלימבית שונים, כגון האמיגדלה - שהגיע לשיא בימים 3 לאחר אוטם לבבי. ליקויים קוגניטיביים והתנהגותיים מופיעים 2-3 שבועות לאחר אוטם לבבי ואלה לתאם סטטיסטיים עם מדדים של caspase-3 פעילות. הפרוטוקול המתואר כאן משמש כדי לגרום לאוטם לבבי, לאסוף רקמת האמיגדלה ולמדוד caspase-3 פעילות באמצעות spectrofluorometry. כדי לגרום לאוטם לבבי, העורק הכלל יורד הוא occluded במשך 40 דקות. הפרוטוקול להערכת caspase-3 הפעלה מתחיל 3 ימים לאחר אוטם לבבי: החולדות הקריבו והאמיגדלה מבודדת אונסיםdly מהמוח. דגימות קפואות במהירות בחנקן נוזלי והמשיכו ב -80 ° C עד ניתוח בפועל. הטכניקה שבוצעה על מנת להעריך caspase-3 הפעלה מבוססת על מחשוף של מצע (DEVD-AMC) על ידי caspase-3, אשר משחרר מתחם fluorogenic שניתן למדוד על ידי spectrofluorometry. המתודולוגיה היא כמותית ושחזור אבל הציוד הנדרש הוא יקר וההליך לכימות הדגימות הוא זמן רב. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות, כגון לב וכליות. ניתן להחליף DEVD-AMC על ידי מצעים אחרים כדי למדוד את הפעילות של caspases האחר.

האמיגדלה הייתה מבודדת בדמה 8 (שליטה) ו8 חולדות MI שלושה ימים אחרי הגיוס של פרוטוקול איסכמיה / reperfusion. Caspase-3 פעילות נמדדה ברקמה זו באמצעות fluorochrome שניתן ביקע ידי caspase-3 הפעיל וזוהה על ידי spectrofluorometry. מדידות חיוביות ושליליות (ראה צעדים 3.11, 3.12 ו3.16) בוצעו בשלושה עותקים ונמדדו במהלך 10 שניות, עם נקודה 1 בכל שנייה. הבדלים בין בקרות חיוביות ושליליות חושבו והממוצע של ההבדלים לכל רקמת הדמה שבוצעה במהלך ניסוי זה נקבע על 100%. תוצאות מחולדות MI היו מדורגים על פי התייחסות זו והאיור 1 מדגים את התוצאות הסופיות: הוא מציין פעילות גבוהה יותר באופן משמעותי בהשוואה לחולדות MI דמה (p &lt;0.05). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> איור 1. caspase-3פעילות באמיגדלה של חולדות MI, הביעה כאחוז מפעילות הממוצעת בבקרת אחיזת עיניים, שנקבעה ל -100% (8 חולדות לכל קבוצה). * מציין משמעותי הבדל בין הקבוצות (p &lt;0.05). הנתונים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM.

Watch this Scientific Journal Video about Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction at JoVE.com

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Views.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Video: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

באוטם שריר הלב אצל חולדות

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Medicine

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochemistry

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל חדש של אי ספיקת לב לאחר אוטם שריר הלב בחולדה

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

מודל חדש של אי ספיקת לב לאחר אוטם שריר הלב בחולדה

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>מבחן פלואורסצנטי להערכת החדירות של מחסום אנדותל מיקרו-וסקולרי לבבי במודל חולדה של איסכמיה/רפרפוזיה

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

מבחן פלואורסצנטי להערכת החדירות של מחסום אנדותל מיקרו-וסקולרי לבבי במודל חולדה של איסכמיה/רפרפוזיה

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל ניסיוני של אוטם שריר הלב לחקר תיקון לב ושיפוץ בעכברי נוקאאוט

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

מודל ניסיוני של אוטם שריר הלב לחקר תיקון לב ושיפוץ בעכברי נוקאאוט

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Caspase-3 פעילות באמיגדלה העכברוש נמדד על ידי Spectrofluorometry לאחר אוטם שריר הלב

Summary

Explore More Videos

באוטם שריר הלב אצל חולדות

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

כימות היסטולוגית של אוטם שריר לב כרוני אצל חולדות

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

מודל חדש של אי ספיקת לב לאחר אוטם שריר הלב בחולדה

מודל חדש של אי ספיקת לב לאחר אוטם שריר הלב בחולדה

מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב

מבחן פלואורסצנטי להערכת החדירות של מחסום אנדותל מיקרו-וסקולרי לבבי במודל חולדה של איסכמיה/רפרפוזיה

מבחן פלואורסצנטי להערכת החדירות של מחסום אנדותל מיקרו-וסקולרי לבבי במודל חולדה של איסכמיה/רפרפוזיה

מודל ניסיוני של אוטם שריר הלב לחקר תיקון לב ושיפוץ בעכברי נוקאאוט