. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Kim Gilbert unterstützt hält ein Stipendium vom Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Die Tiere werden in Übereinstimmung mit der Verordnung des lokalen Animal Care Committee behandelt, in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care. Die Ratten werden individuell unter konstanten Bedingungen untergebracht (Temperatur von 21-22 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 40-50%), einschließlich einer 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, beginnend um 08.00 Uhr. Chow Pellets und Leitungswasser sind ad libitum während der gesamten Studie. Einer Eingewöhnungszeit von 3 Tagen nach Lieferung durch den Lieferanten wird vor dem Experiment erlaubt. Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 300-800 g wurden routinemäßig mit diesem Protokoll verwendet. 1. MI-Chirurgie <ol><li> Induzieren Anästhesie mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin 60 mg / kg und Xylazin 10 mg / kg. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Abwesenheit von Reflex, wenn die Pfoten eingeklemmt werden. </li><li> Rasur Operationsstelle. Intubieren Ratte mit Endotrachealtubus: Katheter (16G 1,77 Zoll) und legen Tier in Seitenlage. Legen Sie die Tiere auf einem Heizkissen auf die Temperatur um 37 ° C zu halten. Verbinden Sie den Endotrachealtubus bis 2% Isofluran. </li><li> Bereiten Operationsstelle mit Chlorhexidingluconat und Isopropylalkohol. Während der Operation verwenden sterile Handschuhe und sterilisierten Instrumente. Bewerben Augensalbe für beide Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Setzen sterilen Bereich auf tierische und die Instrumente auf einem anderen sterilen Bereich neben dem Tier. </li><li> Einzuschneiden Haut mit Skalpellklinge # 10. Ziehen Sie weg Muskelgewebe mit einem blutstillenden Klemme. Legen Sie das Tier in ventralen Dekubitus-Position. Offene Brustwand mit einem blutstillende Klammer und Position der Brust Aufroller. Offene Herzbeutel mit einem blutstillenden Klemme. </li><li> Zur Herstellung Koronarverschluss, Schleife eine 360 ​​mm lange 4-0 Seidennaht auf der absteigenden Koronararterie, die durch die angrenzenden Herzmuskelgewebe. Stecken Sie die beiden Enden des Seidenfaden in ein 14G, 1,25 cm langen Kunststoffrohr. </li><li> Ziehen Sie die beiden Enden des Seidennaht und Eiterh das Rohr nach unten gegen die Arterie, um sie zu verschließen, für 40 Minuten. Sicheren Verschluß durch Klemmen des Kunststoffrohr mit einem hämostatischen Klemme. </li><li> Nach 40 min, lassen Sie die Okklusion durch Lösen der hämostatischen Klemme, gefolgt vom Entfernen des flexiblen Schlauches und Seidennaht. Anmerkung: Sham Kontrollratten unterziehen desselben chirurgischen Eingriffs minus die Okklusion der Koronararterie. </li><li> Vor dem Schließen der Brustwand, legen einen flexiblen Katheter (18 g, 4,5 cm) über der Brusthöhle, um Luft aus dem Brustkorb mit einer 5-ml-Spritze zur Pneumothorax zu verhindern, zu zeichnen. </li><li> Schließen Thoraxhöhle mit 2-0 Nahtstich den Muskel mit 4-0 Seidennaht und die Haut mit 3-0 Seidennaht. </li><li> Vor dem Schließen des letzten Haut Stelle nochmals ziehen Luft aus dem Thorax mit 5-ml-Spritze durch den Katheter vorher im Thoraxhohlraum angeordnet. </li><li> Naht letzten Hautstelle. Stoppen Isofluran Belüftung. </li><li> Überwachen Ratte Erwachen. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es Regained ausreichend Bewusstsein Brustlage zu halten. </li><li> Behandlung von Ratten alle 8 h 24 h mit einem Analgetikum (Buprenorphin 0,05 mg / kg ip) anästhesiert und mit einem Antibiotikum (einer Einzeldosis von duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Nach der Operation Haus Ratten einzeln bis zum Zeitpunkt der Tötung, dh 3 Tage nach MI. </li><li> Infarktgröße, insbesondere Nekrose, wird als das Verhältnis der Infarktgewebe im Risikobereich des linken Ventrikels ausgedrückt. Dies kann unter Verwendung von Triphenyltetrazoliumchlorid Färbung 11. </li></ol> 2. Amygdala Isolation <ol><li> Legen Sie das Tier mit dem Kopf voran in einem kegelförmigen Tasche, mit der Nase aus dem schmalen Ende Öffnung vorsteht. Sichere Ratte jede Bewegung zu vermeiden. Positionieren Sie den Kopf in geeigneter Weise auf der Guillotine, zwischen den Scherenblätter. Enthaupten Tier. </li><li> Place-Kopf der Ratte in einer Schale gehalten auf Crushed Ice. Führen Sie alle Verfahren zur Gewebetrennung auf zerstoßenem Eis (4 ° C). </li><li> Schnitten skVoll mit einer Schere vorsichtig lösen Knochenhüllen mit Bone Rongeurs durch Hochziehen und die Vermeidung von verstümmeln das Gewebe darunter. </li><li> Legen Sie die flache Klinge eines Spatels zwischen der Unterseite des Schädels und der hinteren ventralen Oberfläche des Gehirns und sorgfältig lösen Gehirn von Schädel durch leichtes Drücken der Klinge nach vorne entlang der Unterseite des Schädels, bis das Gehirn kann sich langsam nach oben aus dem gehoben werden Schädel. Entsorgen Sie den Schädel. </li><li> Zeigen Gehirn auf seiner Rückenfläche. Identifizieren Hypothalamus (Struktur vor dem Cerebellum) und schneiden das Gehirn koronal vor seinem vorderen Ende und seinem hinteren Ende hinter; Verwerfen der vorderen und hinteren Teile des Gehirns, wenn auch nicht für andere Zwecke benötigt wird. </li><li> Visualisieren Sie die Amygdala als kleine Kugeln unter den Schläfenlappen, bilateral, direkt neben dem Hypothalamus. </li><li> Flip das Gehirn flach auf seinem vorderen Ende, dorsale Oberfläche weg von der Experimentator. </li><li> Beginnen mit der linken oder der rechten Seite des Gehirns. Trennen Sie die hemiKugeln und dann die Rinde von der angrenzenden Amygdala. Geschnitten Weise über 8 mm dieses lose Kortex der Isolierung der Amygdala ermöglichen. Schneiden Sie Amygdala mit Skalpell. </li><li> Isolieren Sie die basolateralen Teil der Amygdala von seinem centromedial Teil durch Schneiden entlang der dunklen Naht, die sich über sie läuft, fast die Hälfte und die Hälfte. Diese Struktur ist nicht immer leicht erkennbar. </li><li> Setzen Amygdala Unterteile in getrennten identifiziert Fläschchen und auf zerstoßenem Eis zu halten. </li><li> Wiederholungs Dissektion Verfahren mit der anderen Hemisphäre. </li><li> Einzutauchen Fläschchen in flüssigem Stickstoff für 1 min. Halten Fläschchen in -80 ° C Gefrierschrank bis sie benötigt. </li></ol> 3. Caspase-3 Aktivität <ol><li> Vorbereitung Lysepuffer mit 0,32 M Saccharose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 2 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ul Leupeptin , 10 ug / ul Pepstatin A und 10 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l Aprotinin. </li><li>Zugabe von 150 &amp; mgr; l Lysepuffer zu jeder Probe (5-10 mg). Halten Sie auf dem Eis. Beschallen jede Probe auf Eis für 5 s bei maximaler Intensität (40 W). Inkubieren Gewebe in Lysepuffer auf Eis für 30 min. Wirbel jede Probe für 5 min. </li><li> Führen Sie 3 Einfrieren / Auftauen, indem Proben abwechselnd in flüssigem Stickstoff und auf einem thermostatisch gesteuerten Heizplatte bei 37 ° C eingestellt. Zentrifuge Gewebe bei 13.000 g (4 ° C) für 10 min. Überstand vorsichtig abnehmen und halten Sie in Röhrchen auf Eis. </li><li> Sind Standardproteinkonzentrationen zwischen 0 und 10 ug / ml mit Rinderserumalbumin. Bereiten Rohlinge mit nur Puffer. </li><li> Fügen Sie 200 ul von Bradford-Reagenz zu jedem Standard. Lesen Standard bei 595 nm. Für Proteinspiegel werden 5 ul der Probe Überstand in 795 ul destilliertem Wasser und 200 &amp; mgr; l von Bradford-Reagenz. Lesen Sie jede Probe bei 595 nm und zu quantifizieren Protein mit Standardkurve. </li><li> Vorbereitung Reaktionspuffer mit 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure, 0,1% 3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-Propansulfonat und 1 mM Dithiothreitol. </li><li> Man gebe 25 &amp; mgr; g Protein im Reaktionspuffer und Caspase-3-Substrate, um positive und negative Blindproben zu erhalten. Für negative Proben, fügen Reaktionspuffer, 25 &amp; mgr; g Protein, 0,4 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM und 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM. Für positive Proben, fügen Sie 25 ug Protein, um Reaktionspuffer und 0,8 &amp; mgr; l von Ac-DEVD-AMC 10 mM. Verarbeiten alle negativen und positiven Proben in dreifacher Ausfertigung. Füllen Sie das endgültige Volumen jeder Probe bis zu 200 &amp; mgr; l durch Zugabe von Reaktionspuffer. </li><li> Erzeugen negative Kontrollen, indem 188,7 ul Reaktionspuffer und 0,5 ul Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM und 10 ul Lysepuffer. Für positive Kontrollen, fügen 189,2 ul Reaktionspuffer, 0,8 &amp; mgr; l von Ac-DEVD-AMC 10 mM und 10 ul Lysepuffer. </li><li> Proben inkubieren undKontrollen im Dunkeln für 3 Stunden bei 37 o C. </li><li> Stop der Reaktion mit 600 ul 0,4 M Glycin und 0,4 M NaOH (pH 10) in jeder Probe und Kontrolle. </li><li> Quantifizierung Fluoreszenz durch Spektrofluorometrie bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 465 nm. In 2 ml destilliertem Wasser, um die Reaktion in Glasküvetten. Lesen Kontrollen und Proben für 10 Sekunden mit 1 Punkt an jedem sec. </li><li> Quantifizierung spezifischer Aktivität in jeder Probe: ((Fluorescence der negativen Proben minus Fluoreszenz der positiven Proben) x Volumen von 2,8 ml) geteilt durch (Inkubationszeit 3 ​​Stunden x Proteinmenge 25 mg). </li></ol>

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M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unsere Erfahrung mit diesem Protokoll in den letzten 10 Jahren zu der Ermittlung der kritischen methodische Probleme. Erstens ist eine schnelle Gehirn Dissektion in einer Petrischale auf zerstoßenem Eis wichtig, Vorbereitung Qualität aufrecht zu erhalten. Zweitens muss realisiert werden, dass Gewebe Beschallung kürzer für die zerebrale Amygdala Vergleich zu anderen Arten von Geweben, wie dem Herzen (10 sec) oder der Nieren (20 sec). Drittens sollte darauf geachtet, vermischen sorgfältig das Substrat, bevor Sie die Ware in den Proben werden. Wir stießen auf veränderliche Signale, wenn das Mischfolge war unzureichend. Viertens sollten keine Blasen in der Quarzzelle vorhanden sein, wenn das Lesen der Proben. Andernfalls könnte das Signal verändert werden. Wir eine Änderung in den letzten Jahren, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhöhen: Erhöhung der Substrat Volumen zu Volumen von weniger als 1 &amp; mgr; l zu vermeiden. Dennoch können kleine Veränderungen zwischen aufeinander Assays auftreten, und mindestens 3 Kontrollproben verwendet werdenSteuerung für Variationen. Fluoreszenz Maßnahmen dieser Steuerelemente werden gemittelt, und der Mittelwert wird als 100% gesetzt. Fluoreszenz Maßnahmen experimentellen Proben werden in Prozent der Kontrollproben umgewandelt. Eine weitere Einschränkung des Verfahrens ist, dass nur ein Teil des Gewebes verwendet wird und daher die Caspase-3-Aktivität unterschätzt werden kann. Tatsächlich ist das Zeitfenster der Apoptose kurz in jede gegebene Zelle und kann verfehlt werden, obwohl es in den benachbarten Bereichen tritt zum Zeitpunkt der Probenahme 1,4,15. Das Umgekehrte ist ebenfalls möglich: Apoptose konnte in Gewebeteile besonders intensiv sein, was zu einer Überschätzung der Caspase-3-Aktivität. Wir empfehlen die Verwendung von Restgewebe (Amygdala) für komplementäre Techniken wie TUNEL-Assays oder Bax / Bcl-2-Verhältnis (siehe Einleitung). Spektrofluorometrie weist wenigstens zwei Vorteile gegenüber der Western Blot. Erstens, direkt erzeugt quantitative Daten. Zweitens misst er eine enzymatischectivity selbst anstatt Protein oder RNA-Expression, die unabhängig sein können, und es ist bekannt, dass die Proteinexpression kann ohne jede Änderung in der enzymatischen Aktivität erhöht werden. Darüber hinaus kann Spektrofluorometrie auf andere Gewebe oder mit unterschiedlichen Tierarten durchgeführt werden, und kann für andere Caspase Subtypen eingestellt werden kann, mit verschiedenen Substraten, so dass sichere Vergleiche angestellt werden können. Abschließend Dieses Dokument zeigt die Verwendung Spektrofluorometrie Caspase-3-Aktivität in der Amygdala zu messen, den Nachweis, dass die Apoptose tritt in diesem Bereich des limbischen Systems 3 Tage nach MI.

Caspasen oder Cystein-abhängigen Aspartat gerichtete Proteasen sind eine Familie von Enzymen, die in verschiedenen Homöostase processess 1 beteiligt sind. Caspasen können grob nach ihrer Rolle bei der Apoptose oder Entzündung eingestuft werden. Caspase-1, -4, -5 und -12 sind in eine Entzündung involviert während die in Apoptose eingreifen kann unterklassifiziert als Initiatorcaspasen (Caspase-8 und -9) und Vollstrecker Caspasen (Caspase-3, -6 und -7 ). Caspasen spielen eine bedeutende Rolle in vielen Krankheiten, vor allem in Störungen, bei denen die Apoptose kann übermäßig sein, wie nach einem Myokardinfarkt (MI) oder zerebrale Ischämie beobachtet. Im Rattenmodell der in unserem Labor verwendete post-MI-Syndrom festgestellt wird, dass Caspase-3 ist nicht nur im Myokard, sondern auch in 2 des limbischen Systems, die bei der Steuerung der Stimmung und Emotionen 3-6 gebracht wird aktiviert. Es ist auch ersichtlich, dass Caspase-3 ist in verschiedenen Regionen aktiviertendes limbischen Systems, wie der Amygdala und Hippocampus, und diese Aktivierung Gipfel rund 3 Tage nach dem ischämischen Insult 4. Interessant ist, dass Caspase-3-Aktivität korreliert mit post-MI Verhaltensstörungen, und dessen Dämpfung durch pharmakologische und ernährungsphysiologischen Interventionen reduziert diese Verletzungen, was auf eine mögliche Verbindung zwischen Caspase-3-und Post-MI Depressionen 7-12. Caspase-3-Aktivierung kann nach verschiedenen Techniken gemessen werden. Westernblot ermittelt die enzymatischen Eigenschaften der Caspasen und aktive Enzyme sowie ihre pro-Enzymformen zu detektieren. Western-Blot, jedoch semi-quantitative und kleine Abweichungen können durch schwaches Signal-Rausch-Verhältnissen 13 verloren. Eine bessere Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung freigibt und spektrofluorometrisch gemessen werden kann. Caspase-3-Aktivierung ist ein zuverlässiger Marker für Apoptose. Die Messung der Apoptose can ist instabil, da das Zeitfenster für das Auftreten kurz ist, und der Nachbarzellen apoptotische Körper oder Zellen 14 phagozytieren können. Die Apoptose kann durch andere Techniken, wie Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Test bestätigt werden, dass die DNA-Fragmentierung von apoptotischen Signalkaskaden 6, oder das Verhältnis der Pro- / anti-apoptotische Proteine ​​wie Bax / resultierenden erkennt Bcl2 6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectroflurometer</td>
			<td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td>
			<td>Ratiomaster M-40</td>
			<td>with DeltaRAM&#160; Random Access Monochromator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Respirator</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>683</td>
			<td>small animal ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cuvette</td>
			<td>NSG precision cells</td>
			<td>3G10</td>
			<td>Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>4710&#160; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 50 Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

Myokardinfarkt (MI) hat dramatische mittel- und langfristigen Auswirkungen auf die physiologischen und verhaltens Ebenen, aber die Mechanismen sind noch unklar. Unser Labor hat ein Rattenmodell der Post-MI-Syndrom, die eingeschränkter Herzfunktion, Verlust von Nervenzellen im limbischen System, kognitive Defizite und Verhaltens Anzeichen einer Depression zeigt entwickelt. Auf neuronaler Ebene, vermittelt Caspase-3-Aktivierung post-MI Apoptose in verschiedenen limbischen Regionen, wie der Amygdala - Spitzenwert von 3 Tagen nach der MI. Kognitiven und Verhaltensstörungen erscheinen 2-3 Wochen post-MI und diese korreliert statistisch mit Maßnahmen der Caspase-3-Aktivität. Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um zu induzieren MI, sammeln Amygdala Gewebe und messen Caspase-3-Aktivität unter Verwendung Spektrofluorometrie. Um MI zu induzieren, wird der absteigenden Koronararterie für 40 Minuten verschlossen. Das Protokoll für die Auswertung der Caspase-3-Aktivierung beginnt 3 Tage nach MI: die Ratten getötet und die Amygdala isoliert rapiDLY aus dem Gehirn. Proben werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gehalten, bis tatsächliche Analyse. Durchgeführt, um die Caspase-3-Aktivierung beurteilen Technik basiert auf der Spaltung eines Substrats (DEVD-AMC), die durch Caspase-3, die eine fluorogene Verbindung, die durch Spektrofluorometrie gemessen werden kann, freisetzt. Die Methodik ist quantitativ und reproduzierbar, aber die erforderliche Ausrüstung ist teuer und das Verfahren für die Quantifizierung der Proben ist zeitaufwendig. Diese Technik kann auf anderen Geweben, wie Herz und Niere verwendet werden. DEVD-AMC durch andere Substrate ersetzt werden, um die Aktivität von anderen Caspasen messen.

Die Amygdala wurde in 8 sham (Kontrolle) und 8 MI-Ratten drei Tage nach der Induktion der Ischämie / Reperfusion-Protokoll isoliert. Caspase-3-Aktivität wurde in diesem Gewebe mit Hilfe eines Fluorochroms, die durch aktive Caspase-3 gespalten und spektrofluorometrisch detektiert werden kann, gemessen. Positive und negative Messwerte (siehe Schritte 3.11, 3.12 und 3.16) wurden dreifach während 10 Sekunden durchgeführt und gemessen, wobei 1 Punkt an jedem sec. Unterschiede zwischen den positiven und negativen Kontrollen berechnet und der Mittelwert der Differenzen für alle Scheingewebe während dieses Experiment durchgeführt wurde auf 100% gesetzt. Ergebnisse aus MI-Ratten wurden nach dieser Referenz skaliert und Abbildung 1 zeigt die Endergebnisse: zeigt eine signifikant höhere Aktivität im MI-Ratten gegenüber Sham (p &lt;0,05). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Abbildung 1. Caspase-3-Aktivität in der Amygdala von MI-Ratten, ausgedrückt als Prozentsatz der mittleren Aktivität in Schein-Kontrollen, um 100% (8 Ratten pro Gruppe) festgelegt. * Zeigt signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (p &lt;0,05). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Aufrufe.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Serie: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Fokaler zerebraler Ischämie-Modell von Endovascular Suture Verschluss der mittleren Hirnarterie im Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Forschung

Neurowissenschaften

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a reduction in neuronal population and function. Damaged axons can release excitatory molecules including potassium or glutamate into the extracellular matrix, which in turn, can produce further insult and injury to the supporting glial cells including astrocytes and oligodendrocytes 8, 16. If the insult persists, cells will undergo programmed cell death (apoptosis), which is regulated and activated by a number of well-established signal transduction cascades 14. Apoptosis and tissue necrosis can occur after traumatic brain injury, cerebral ischemia, and seizures. A classical example of apoptotic regulation is the family of cysteine-dependent aspartate-directed proteases, or caspases. Activated proteases including caspases have also been implicated in cell death in response to chronic neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Multiple Sclerosis 4, 14, 3, 11, 7.
In this protocol we describe the use of the NucView 488 caspase-3 substrate to measure the rate of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte (OLG) cell cultures 15, 5, following exposure to different extracellular stresses such as high concentrations of potassium or glutamate. The conditionally-immortalized N19-OLG cell line (representing the O2A progenitor) was obtained from Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, and has been previously used to study molecular mechanisms of myelin gene expression and signal transduction leading to OLG differentiation (e.g.6, 10). We have found this cell line to be robust with respect to transfection with exogenous myelin basic protein (MBP) constructs fused to either RFP or GFP (red or green fluorescent protein) 13, 12. Here, the N19-OLG cell cultures were treated with either 80 mM potassium chloride or 100 mM sodium glutamate to mimic axonal leakage into the extracellular matrix to induce apoptosis 9. We used a bi-functional caspase-3 substrate containing a DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 recognition subunit and a DNA-binding dye 2. The substrate quickly enters the cytoplasm where it is cleaved by intracellular caspase-3. The dye, NucView 488 is released and enters the cell nucleus where it binds DNA and fluoresces green at 488 nm, signaling apoptosis. Use of the NucView 488 caspase-3 substrate allows for live-cell imaging in real-time 1, 10. In this video, we also describe the culturing and transfection of immortalized N19-OLG cells, as well as live-cell imaging techniques.

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell imaging of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte cell cultures using the NucView 488 caspase-3 substrate. This technique is applicable for programmed cell death assays in real-time in a variety of cell types and tissues.

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Die Analyse der Genexpression Veränderungen im Hippocampus Ratte nach Tiefenhirnstimulation des Anterior Thalamuskern

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when compared to warm-blooded vertebrates. Because of this, in vitro experiments in turtles can be performed for extended periods of time to investigate the neural signals and control of their target actions. Using an isolated head preparation, we measured the kinematics of eye movements in turtles, and their modulation by electrical signals carried by cranial nerves. After the brain was removed from the skull, leaving the cranial nerves intact, the dissected head was placed in a gimbal to calibrate eye movements. Glass electrodes were attached to cranial nerves (oculomotor, trochlear, and abducens) and stimulated with currents to evoke eye movements. We monitored eye movements with an infrared video tracking system and quantified rotations of the eyes. Current pulses with a range of amplitudes, frequencies, and train durations were used to observe effects on responses. Because the preparation is separated from the brain, the efferent pathway going to muscle targets can be examined in isolation to investigate neural signaling in the absence of centrally processed sensory information.

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

This protocol describes how to use an in vitro isolated turtle head preparation to measure the kinematics of their eye movements. After removal of the brain from the cranium, cranial nerves can be stimulated with currents to quantify rotations of the eye and changes in pupil sizes.

Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also demonstrate that traumatic brain injuries cause changes to the gut microbiota. However, mechanisms underlying the bidirectional regulation of the brain-gut axis remain unknown. Currently, few models exist for studying the changes in gut microbiota after traumatic brain injury. Therefore, the presented study combines protocols for inducing traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device and analysis of caecum samples following injury for investigating alterations in the gut microbiome. Alterations of the gut microbiota composition after traumatic brain injury are determined using 16S-rDNA sequencing. This protocol provides an effective method for studying the relationships between enteric microorganisms and traumatic brain injury.

Presented here is a protocol to induce diffuse traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device followed by the collection of the caecum content for gut microbiome analysis.

Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Einrichtung eines akuten Pontininfarkts bei Ratten durch elektrische Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Caspase-3-Aktivität in der Ratte Amygdala spektrofluorometrisch Gemessen nach Myokardinfarkt

Zusammenfassung

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