. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Ciências Naturais e Council of Canada Kim Gilbert Pesquisa de Engenharia detém uma bolsa de estudo de Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Os animais são tratados em conformidade com as regulamentações do Comitê Animal Care o local, de acordo com as orientações do Canadian Council on Animal Care. Os ratos são alojados individualmente, sob condições constantes (temperatura de 21-22 ºC e umidade de 40-50%), incluindo um 12 hr ciclo escuro-claro, com início às 08h00. Pelotas de comida e água da torneira estão disponíveis ad libitum durante todo o estudo. Um período de aclimatação de 3 dias após a entrega pelo fornecedor é permitido antes do experimento. Ratos machos Sprague-Dawley pesando entre 300-800 g foram rotineiramente usado com este protocolo. 1. Cirurgia MI <ol><li> Induzir anestesia com injecções intraperitoneais de cetamina 60 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg. Confirme anesthetization adequada por ausência de reflexo quando as patas são trilhados. </li><li> Raspar sítio cirúrgico. Intubate rato com tubo endotraqueal: cateter (16G 1,77 polegadas) e colocá animal em decúbito lateral. Colocar os animais numa almofada de aquecimento para manter a temperatura de cerca de 37 ° C. Conecte o tubo endotraqueal ao isoflurano a 2%. </li><li> Prepare sítio cirúrgico com gluconato de clorexidina e álcool isopropílico. Durante a cirurgia, usar luvas estéreis e instrumentos esterilizados. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos para prevenir a secura e sob anestesia. Coloque campo estéril em animais e os instrumentos no outro campo estéril ao lado do animal. </li><li> Inciso pele com lâmina de bisturi nº 10. Descolar o tecido muscular com uma pinça hemostática. Colocar o animal em decúbito ventral. Abrir parede torácica com uma pinça e posição afastador peito hemostático. Abrir pericárdio com uma pinça hemostática. </li><li> Para produzir a oclusão coronária, um circuito de 360 ​​mm de comprimento de sutura de seda 4-0 à volta da artéria coronária descendente, passando através do tecido do miocárdio contígua. Insira ambas as extremidades do fio de sutura de seda num 14G, 1,25 cm longo tubo de plástico. </li><li> Puxar ambas as extremidades da sutura de seda e push do tubo para baixo contra a artéria para ocluir-lo, por 40 min. Oclusão seguro por aperto o tubo de plástico com uma pinça hemostática. </li><li> Após 40 min, a oclusão por libertar a abertura da pinça hemostática, seguido por remoção do tubo flexível e sutura de seda. Nota: ratos controle Sham submetidas ao mesmo procedimento cirúrgico menos a oclusão da artéria coronária. </li><li> Antes de fechar a parede torácica, colocar um cateter flexível (18 g, 4,5 cm) através da cavidade torácica a extrair o ar para fora do tórax com uma seringa de 5 ml para evitar pneumotórax. </li><li> Fechar tórax cavidade com sutura 2-0, ponto do músculo com fio de seda 4-0 ea pele com sutura de seda 3-0. </li><li> Antes de fechar o último ponto da pele, de novo aspirar o ar para fora do tórax com 5 ml da seringa através do cateter colocado previamente na cavidade do tórax. </li><li> Suturar último ponto da pele. Pare de ventilação isoflurano. </li><li> Monitorar despertar rato. Não deixe um animal sem supervisão até que ele tem Regained consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Tratar de rato a cada 8 horas durante 24 h com um analgésico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip) e com um antibiótico (uma única dose de duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Após a cirurgia, os ratos de casas individualmente até à hora de sacrifício, ou seja, 3 dias de pós-MI. </li><li> Tamanho do enfarte, necrose, principalmente, é expressa como a percentagem de tecido enfartado em a área em risco de o ventrículo esquerdo. Isto pode medido usando coloração 11 trifeniltetrazólio. </li></ol> 2. Amygdala Isolamento <ol><li> Coloque a cabeça de animal pela primeira vez em um saco em forma de cone, com o nariz saliente da abertura extremidade mais estreita. Rato seguro para evitar qualquer movimento. Posicione sua cabeça de forma adequada na guilhotina, entre as lâminas da tesoura. Decapitar animal. </li><li> Coloque a cabeça do rato em um prato mantidos em gelo picado. Efectuar todos os procedimentos para o isolamento do tecido em gelo picado (4 ° C). </li><li> Sk aberta Corteull com uma tesoura, retire cuidadosamente bainhas ósseas com fórceps osso, puxando para cima e evitando mutilando o tecido embaixo. </li><li> Colocar a lâmina achatada de uma espátula entre a parte inferior do crânio e a superfície ventral posterior do cérebro e cuidadosamente separar cérebro do crânio empurrando cuidadosamente a lâmina para a frente ao longo da parte inferior do crânio até ao cérebro pode ser levantada lentamente para fora do crânio. Descarte o crânio. </li><li> Coloque cérebro em sua superfície dorsal. Identificar hipotálamo (estrutura em frente do cerebelo) e cortar o cérebro coronalmente em frente da sua extremidade anterior e por trás da sua extremidade posterior; descartar as anterior e posterior partes do cérebro se não for necessário para outros usos. </li><li> Visualize as amígdalas como pequenas esferas debaixo dos lobos temporais, bilateralmente, mesmo ao lado do hipotálamo. </li><li> Virar o plano cerebral em sua extremidade frontal, superfície dorsal longe do experimentador. </li><li> Comece com o lado esquerdo ou direito do cérebro. Separe o hemiesferas e, em seguida, o córtex da amígdala contígua. Cortar caminho de cerca de 8 mm desta córtex solto para permitir o isolamento da amígdala. Cortar amígdala com bisturi. </li><li> Isolar a parte basolateral da amígdala de sua parte centromedial cortando ao longo da sutura escuro que atravessa-lo, quase meio a meio. Esta estrutura nem sempre é facilmente identificável. </li><li> Coloque subparts amígdala em frascos separados e identificados manter em gelo picado. </li><li> Procedimento de dissecção Repita com o outro hemisfério. </li><li> Mergulhe frascos em azoto líquido durante 1 min. Manter frasco em freezer -80 ° C até serem necessárias. </li></ol> 3. Actividade de Caspase-3 <ol><li> Preparar tampão de lise com 0,32 M de sacarose, 1% de Triton-X-100, 10 mM de Tris-HCl, pH 8, 5 mM de ácido etilenodiaminotetra-acético, 2 mM de ditiotreitol, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 10 ug / mL de leupeptina , 10 ug / mL de pepstatina A e 10 ug / mL de aprotinina. </li><li>Adicionar 150 ul de tampão de lise a cada amostra (5-10 mg). Manter em gelo. Sonicar cada amostra em gelo durante 5 segundos a intensidade máxima (40 W). Incubar o tecido em tampão de lise em gelo durante 30 min. Vortex cada amostra durante 5 minutos. </li><li> Realizar 3 ciclos de congelamento / descongelamento, colocando alternadamente amostras em azoto líquido e numa placa de aquecimento controlado termostaticamente ajustado a 37 ° C. Centrifugar o tecido a 13.000 g (4 ° C) durante 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante e manter em tubo em gelo. </li><li> Prepare a concentrações de proteína padrão entre 0 e 10 ug / ml, com albumina de soro bovino. Prepare espaços em branco, com apenas tampão. </li><li> Adicionar 200 ul de reagente de Bradford a cada padrão. Leia padrão a 595 nm. Para níveis de proteína, adicionam-se 5 ul de amostra de sobrenadante a 795 ul de água destilada e 200 ul de reagente de Bradford. Leia cada amostra a 595 nm e quantificar a proteína com curva padrão. </li><li> Preparar tampão de reacção com 50 mM de Tris-HCl, pH 7, 5 mM de MgCl2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM de ácido tetra-acético de etileno glicol, 0,1% de 3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulf onato e 1 mM de ditiotreitol. </li><li> Adicionam-se 25 ug de proteína para tampão de reacção e substratos de caspase-3 para obter amostras reactivas positivos e negativos. Para as amostras negativas, adicionar tampão de reacção, 25 ug de proteína, 0,4 ul de Ac-DEVD-CHO 800 uM e 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Para amostras positivas, adicionar 25 mg de proteína para tampão de reacção e 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM. Processar todas as amostras negativas e positivas em triplicado. Completar o volume final de cada amostra até 200 mL por adição de tampão de reacção. </li><li> Produção de controlos negativos pela adição de 188,7 ul de tampão de reacção de 0,5 ul de Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 ul Ac-DEVD-AMC 10 mM e 10 ul de tampão de lise. Para os controlos positivos, adicionar 189,2 ul de tampão de reacção, 0,8 ul de Ac-DEVD-AMC 10 mM e 10 ul de tampão de lise. </li><li> Incubar as amostras econtroles no escuro durante 3 horas a 37 o C. </li><li> Parar a reacção com 600 ul de glicina 0,4 M e NaOH a 0,4 M (pH 10) em cada amostra e controlo. </li><li> Quantificar fluorescência por espectrofluorometria no comprimento de onda de excitação de 365 nm de comprimento de onda e emissão de 465 nm. Adicionar 2 ml de água destilada a reacção na cuvete de vidro. Leia controles e amostras de 10 segundos com um ponto em cada segundo. </li><li> Quantificar a actividade específica de cada amostra: ((fluorescência de amostras negativas menos fluorescência de amostras positivas) x volume de 2,8 ml) dividido por (tempo de incubação de 3 h x quantidade de proteína de 25 mg). </li></ol>

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	<li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+keys+in+the+ignition+of+cell+death.">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li><li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors:+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway.">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala.">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li><li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li><li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model.">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li><li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression.">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li><li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Killing+the+blues':+a+role+for+cellular+suicide+(apoptosis)+in+depression+and+the+antidepressant+response.">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways:+paper+wraps+stone+blunts+scissors.">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nossa experiência com este protocolo durante os últimos 10 anos levou à identificação de questões metodológicas críticas. Em primeiro lugar, dissecção rápido do cérebro em uma placa de Petri sobre gelo moído é importante para manter a qualidade da preparação. Em segundo lugar, deve-se perceber que a ultra-sons de tecido é mais curto para a amígdala cerebral em comparação com outros tipos de tecidos, tais como o coração (10 seg) ou rins (20 sec). Em terceiro lugar, deve ser tomado muito cuidado para misturar cuidadosamente o substrato antes de adicionar as amostras. Encontramos sinais variáveis ​​quando a sequência de mistura foi inadequada. Em quarto lugar, não há bolhas deve estar presente na célula de quartzo, quando da leitura das amostras. Caso contrário, o sinal pode ser alterada. Nós fizemos uma mudança nos últimos anos para aumentar a reprodutibilidade dos resultados: aumento do volume do substrato a fim de evitar o volume inferior a 1 mL. Ainda, pequenas variações podem ocorrer entre ensaios sucessivos, e, pelo menos, 3 amostras de controlo devem ser usadas parade controlo para variações. Medidas de fluorescência destes controlos são calculados e a média é estabelecida em 100%. Medidas de fluorescência em amostras experimentais são transformados em percentagem das amostras de controlo. Outra limitação da técnica é que apenas uma parte do tecido é utilizado e, por conseguinte, a actividade da caspase-3 pode ser subestimada. Com efeito, a janela de tempo de apoptose é curto em qualquer dada célula e pode ser dispensada, mesmo que ocorre em áreas vizinhas na altura da amostragem 1,4,15. O inverso é também possível: a apoptose pode ser particularmente intenso em porções de tecido, resultando em sobreavaliação da actividade da caspase-3. Recomendamos a utilização de tecidos remanescentes (amígdala) para técnicas complementares, tais como ensaios de TUNEL ou razão Bax / Bcl2 (ver Introdução). Espectrofluorometria tem pelo menos duas vantagens sobre Western blotting. Em primeiro lugar, diretamente gera dados quantitativos. Em segundo lugar, mede um enzimáticaem si, em vez de expressão da proteína ou RNA, que podem ser independentes, e sabe-se que a expressão da proteína pode ser aumentada sem qualquer alteração na actividade enzimática ctividades. Além disso, espectrofluorometria pode ser realizado em outros tecidos ou com diferentes espécies de animais e podem ser ajustados para outros subtipos de caspase, com diferentes substratos, de modo que as comparações de segurança pode ser feita. Em conclusão, este documento demonstra o uso de espectrofluorometria para medir a actividade da caspase-3 na amígdala, fornecendo a evidência de que a apoptose ocorre nesta região do sistema límbico 3 dias depois do MI.

As caspases ou proteases de aspartato dirigida-cisteína-dependentes são uma família de enzimas que estão envolvidas em vários homeostase processess 1. Caspases podem ser classificados de acordo com seus papéis na apoptose ou inflamação. A caspase-1, -4, -5 e -12 estão envolvidos na inflamação enquanto que aqueles envolvidos na apoptose pode ser sub-classificados como caspases iniciadoras (caspase-8 e -9) e caspases executoras (caspase-3, -6 e -7 ). As caspases desempenham papéis importantes em muitas patologias, principalmente em desordens nas quais a apoptose pode ser excessivo, como observado após enfarte do miocárdio (MI) ou isquemia cerebral. No modelo de rato da síndrome pós-MI utilizado no nosso laboratório, ficou estabelecido que a caspase-3 é activado, não só no miocárdio 2, mas também no sistema límbico, que está implicada no controlo do humor e emoções 3-6. Veja-se também que a caspase-3 é activado em diferentes regiõesdo sistema límbico, tal como a amígdala e o hipocampo, e esta activação picos em torno de 3 dias após o insulto isquémico 4. Curiosamente, a caspase-3 atividade está correlacionada com pós-MI deficiências comportamentais, e sua atenuação por meio de intervenções farmacológicas e nutricionais reduz essas lesões, o que sugere uma possível ligação entre caspase-3 e depressão pós-MI 7-12. A caspase-3 de activação pode ser medida por várias técnicas. Western blotting verifica as propriedades enzimáticas dos caspases e pode detectar enzimas activas, bem como as suas formas de pró-enzima. Western blotting, no entanto, é semi-quantitativa, e pequenas variações podem ser perdida através fracos sinal-ruído rácios 13. Uma melhor técnica baseia-se na clivagem de um substrato (DEVD-AMC), através da caspase-3 que liberta um composto fluorogénico e podem ser medidos por espectrofluorometria. Caspase-3 é um marcador de activação é confiável de apoptose. Medição da apoptose CAn ser instável porque a janela de tempo de ocorrência é curto, e as células vizinhas poderia fagocitar corpos apoptóticos ou células 14. A apoptose pode ser ainda confirmada por outras técnicas, tais como a desoxinucleotidil transferase terminal dUTP nick end rotulagem (TUNEL) ensaio, que detecta a fragmentação de ADN resultante de cascatas de sinalização de apoptose, 6 ou a proporção de proteínas pró / anti-apoptótica, tal como a Bax / Bcl2 6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectroflurometer</td>
			<td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td>
			<td>Ratiomaster M-40</td>
			<td>with DeltaRAM&#160; Random Access Monochromator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Respirator</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>683</td>
			<td>small animal ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cuvette</td>
			<td>NSG precision cells</td>
			<td>3G10</td>
			<td>Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>4710&#160; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 50 Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

O infarto do miocárdio (MI) tem de médio e longo prazo consequências dramáticas nos níveis fisiológicos e comportamentais, mas os mecanismos envolvidos ainda não estão claros. Nosso laboratório desenvolveu um modelo de rato da síndrome pós-MI que exibe funções prejudicadas cardíacas, perda neuronal no sistema límbico, déficits cognitivos e comportamentais sinais de depressão. No nível neuronal, ativação da caspase-3 medeia pós-MI apoptose em diferentes regiões límbicas, como a amígdala - atingindo um máximo de 3 dias pós-MI. Alterações cognitivas e comportamentais aparecem 2-3 semanas pós-MI e estes correlacionar estatisticamente com medidas de caspase-3 atividade. O protocolo aqui descrito é utilizado para induzir MI, coletar tecido amígdala e medir caspase-3 atividade usando espectrofluorometria. Para induzir a MI, a artéria coronária descendente é obstruída durante 40 minutos. O protocolo para a avaliação da activação da caspase-3 começa depois de 3 dias MI: os ratos são sacrificados e a amígdala isolado rapiDLY a partir do cérebro. As amostras são rapidamente congeladas em azoto líquido e mantido a -80 ° C até à análise real. A técnica utilizada para avaliar a activação de caspase-3 baseia-se na clivagem de um substrato (DEVD-AMC) por caspase-3, o qual liberta um composto fluorogénico que pode ser medido por espectrofluorometria. A metodologia é quantitativo e reprodutível, mas o equipamento necessário é caro e o procedimento para quantificar as amostras é demorado. Esta técnica pode ser aplicada a outros tecidos, tais como o coração e os rins. DEVD-AMC pode ser substituído por outros substratos para medir a actividade de outras caspases.

A amígdala foi isolado em 8 simulada (controlo) e 8 mi ratos três dias após a indução do protocolo de isquemia / reperfusão. A caspase-3 foi medida a actividade neste tecido usando um fluorocromo que pode ser clivada pela caspase-3 activa e detectado por espectrofluorometria. Medidas positivas e negativas (ver passos 3.11, 3.12 e 3.16) foram realizadas em triplicado e medido durante 10 segundos, com um ponto em cada segundo. As diferenças entre os controlos positivos e negativos foram calculadas e a média das diferenças para todo o tecido simulado realizada durante esta experiência foi fixada em 100%. Os resultados de ratos MI foram dimensionados de acordo com esta referência e A Figura 1 ilustra os resultados finais: indica uma actividade significativamente mais elevada nos ratos MI em comparação com sham (p &lt;0,05). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figura 1. A caspase-3actividade na amígdala de ratos MI, expressa como percentagem de actividade significativo em controlos simulados, definida como 100% (8 ratos por grupo). * Indica diferença significativa entre os grupos (p &lt;0,05). Os dados são expressos como média ± SEM.

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspase-3 Atividade no Rat Amygdala Medido pelo espectrofluorometria Após Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K visualizações.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Vídeo: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

Modelo de isquemia focal cerebral por oclusão Suture Endovascular da artéria cerebral média no Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Neurociência

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a reduction in neuronal population and function. Damaged axons can release excitatory molecules including potassium or glutamate into the extracellular matrix, which in turn, can produce further insult and injury to the supporting glial cells including astrocytes and oligodendrocytes 8, 16. If the insult persists, cells will undergo programmed cell death (apoptosis), which is regulated and activated by a number of well-established signal transduction cascades 14. Apoptosis and tissue necrosis can occur after traumatic brain injury, cerebral ischemia, and seizures. A classical example of apoptotic regulation is the family of cysteine-dependent aspartate-directed proteases, or caspases. Activated proteases including caspases have also been implicated in cell death in response to chronic neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Multiple Sclerosis 4, 14, 3, 11, 7.
In this protocol we describe the use of the NucView 488 caspase-3 substrate to measure the rate of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte (OLG) cell cultures 15, 5, following exposure to different extracellular stresses such as high concentrations of potassium or glutamate. The conditionally-immortalized N19-OLG cell line (representing the O2A progenitor) was obtained from Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, and has been previously used to study molecular mechanisms of myelin gene expression and signal transduction leading to OLG differentiation (e.g.6, 10). We have found this cell line to be robust with respect to transfection with exogenous myelin basic protein (MBP) constructs fused to either RFP or GFP (red or green fluorescent protein) 13, 12. Here, the N19-OLG cell cultures were treated with either 80 mM potassium chloride or 100 mM sodium glutamate to mimic axonal leakage into the extracellular matrix to induce apoptosis 9. We used a bi-functional caspase-3 substrate containing a DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 recognition subunit and a DNA-binding dye 2. The substrate quickly enters the cytoplasm where it is cleaved by intracellular caspase-3. The dye, NucView 488 is released and enters the cell nucleus where it binds DNA and fluoresces green at 488 nm, signaling apoptosis. Use of the NucView 488 caspase-3 substrate allows for live-cell imaging in real-time 1, 10. In this video, we also describe the culturing and transfection of immortalized N19-OLG cells, as well as live-cell imaging techniques.

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell imaging of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte cell cultures using the NucView 488 caspase-3 substrate. This technique is applicable for programmed cell death assays in real-time in a variety of cell types and tissues.

Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Análise das Alterações Gene expressão no Rat Hippocampus Após Estimulação Cerebral Profunda do Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when compared to warm-blooded vertebrates. Because of this, in vitro experiments in turtles can be performed for extended periods of time to investigate the neural signals and control of their target actions. Using an isolated head preparation, we measured the kinematics of eye movements in turtles, and their modulation by electrical signals carried by cranial nerves. After the brain was removed from the skull, leaving the cranial nerves intact, the dissected head was placed in a gimbal to calibrate eye movements. Glass electrodes were attached to cranial nerves (oculomotor, trochlear, and abducens) and stimulated with currents to evoke eye movements. We monitored eye movements with an infrared video tracking system and quantified rotations of the eyes. Current pulses with a range of amplitudes, frequencies, and train durations were used to observe effects on responses. Because the preparation is separated from the brain, the efferent pathway going to muscle targets can be examined in isolation to investigate neural signaling in the absence of centrally processed sensory information.

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

This protocol describes how to use an in vitro isolated turtle head preparation to measure the kinematics of their eye movements. After removal of the brain from the cranium, cranial nerves can be stimulated with currents to quantify rotations of the eye and changes in pupil sizes.

Cinemática ocular medida na Vitro estimulação dos nervos cranianos na tartaruga

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also demonstrate that traumatic brain injuries cause changes to the gut microbiota. However, mechanisms underlying the bidirectional regulation of the brain-gut axis remain unknown. Currently, few models exist for studying the changes in gut microbiota after traumatic brain injury. Therefore, the presented study combines protocols for inducing traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device and analysis of caecum samples following injury for investigating alterations in the gut microbiome. Alterations of the gut microbiota composition after traumatic brain injury are determined using 16S-rDNA sequencing. This protocol provides an effective method for studying the relationships between enteric microorganisms and traumatic brain injury.

Presented here is a protocol to induce diffuse traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device followed by the collection of the caecum content for gut microbiome analysis.

Investigando alterações na microbiota de caecum após traumatismo cranioencefálico em camundongos

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

Estabelecimento de Infarto Agudo de Pontina em Ratos por Estimulação Elétrica

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

Unraveling the Role of Discrete Areas of the Rat Brain in the Regulation of Ovulation through Reversible Inactivation by Tetrodotoxin Microinjections

Many experimental approaches have been used for studying the role of the brain in the regulation of ovulation. Examples include the lesion and deafferentation of neuronal groups, which are both invasive methods that permanently impair the integrity of the target area. These methods are accompanied by collateral effects that can affect the analysis of acute and temporal regulatory mechanisms. The stereotaxic implantation of guide cannulas aimed at specific brain regions, followed by a recovery period, allows researchers to microinject different drugs after the disappearance of the undesired effects of the surgery. Tetrodotoxin has been used to determine the roles of several brain areas in diverse physiological processes because it transiently inhibits the sodium-dependent action potentials, thus blocking all neural activity in the target region. This protocol combines this method with strategies for the assessment of the estrous cycle and ovulation to reveal the role of discrete brain regions in the regulation of ovulation at particular times of any given stage of the estrous cycle. Awake and unrestrained rats (Rattus norvegicus) were used to avoid the blocking effects that anesthetics and stress hormones exert on ovulation. This protocol can be easily adapted to other species, brain targets and pharmacological agents to study different physiological processes. Future improvements to this method include the design of a microinjection system using glass capillaries of small diameter instead of guide cannulas. This will reduce the amount of tissue damaged during the implantation and decrease the spread of the infused drugs outside the target area.

This protocol describes the construction of a low-cost microinjection system, its stereotaxic implantation into deep-brain structures and the procedure for timed microinjections of tetrodotoxin in awake and unrestrained rats. The goal is to reveal the participation of hypothalamic structures in the regulation of ovulation by inhibiting their neural activity.

Desvendando o papel das áreas discretas do cérebro de rato na regulação da ovulação através da inativação reversível por microinjeções de tetrodotoxinas