. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada Kim Gilbert tiene una borsa di studio da Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Gli animali sono trattati in conformità al regolamento del comitato locale di cura degli animali, in conformità con le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali. I ratti sono alloggiati individualmente in condizioni costanti (temperatura di 21-22 ° C e l&#39;umidità del 40-50%), tra cui un 12 hr ciclo luce-buio, con inizio alle 08:00. Pellet Chow e acqua di rubinetto sono disponibili ad libitum durante lo studio. Un periodo di acclimatazione di 3 giorni dopo la consegna da parte del fornitore è consentito prima dell&#39;esperimento. Ratti maschi Sprague-Dawley di peso compreso tra 300-800 g sono stati regolarmente utilizzati con questo protocollo. 1. MI Chirurgia <ol><li> Indurre anestesia con iniezioni intraperitoneali di ketamina 60 mg / kg e xilazina 10 mg / kg. Verificare il corretto anestesia dall&#39;assenza di riflessi quando le zampe sono schiacciati. </li><li> Shave sito chirurgico. Intubare ratto con tubo endotracheale: catetere (16G 1.77 pollici) e porre animali in decubito laterale. Mettere gli animali su una piastra elettrica per mantenere la temperatura intorno ai 37 ° C. Collegare il tubo endotracheale per Isoflurano 2%. </li><li> Preparare sito chirurgico con clorexidina gluconato e alcool isopropilico. Durante l&#39;intervento chirurgico, utilizzare guanti sterili e strumenti sterilizzati. Applicare pomata oftalmica per entrambi gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Mettere campo sterile su animali e gli strumenti su un altro campo sterile accanto all&#39;animale. </li><li> Incidere la pelle con bisturi # 10. Staccare il tessuto muscolare con un morsetto emostatico. Posto l&#39;animale in decubito ventrale. Aperto parete toracica con una pinza e la posizione emostatico divaricatore petto. Aprire pericardio con un morsetto emostatico. </li><li> Per produrre l&#39;occlusione coronarica, un anello 360 mm lungo sutura di seta 4-0 intorno all&#39;arteria coronaria discendente, passando attraverso il tessuto miocardico contigua. Inserire entrambe le estremità della sutura di seta in un 14G, 1,25 cm lungo tubo di plastica. </li><li> Tirare entrambe le estremità della sutura di seta e push il tubo obliquo contro l&#39;arteria per occludere esso, per 40 min. Occlusione sicuro, fissando il tubo di plastica con un morsetto emostatico. </li><li> Dopo 40 min, rilasciare l&#39;occlusione rilasciando il morsetto emostatico, seguita dalla rimozione del tubo flessibile e seta sutura. Nota: ratti di controllo Sham subiscono la stessa procedura chirurgica meno l&#39;occlusione dell&#39;arteria coronaria. </li><li> Prima di chiudere la parete toracica, posizionare un catetere flessibile (18G, 4,5 cm) attraverso la cavità toracica per aspirare aria dal torace con una siringa da 5 ml per evitare pneumotorace. </li><li> Chiudi torace cavità con 2-0 sutura, punto il muscolo con 4-0 sutura di seta e la pelle con 3-0 sutura di seta. </li><li> Prima di chiudere l&#39;ultimo punto pelle, ancora aspirare aria dal torace con siringa da 5 ml attraverso il catetere posizionato precedentemente nella cavità toracica. </li><li> Suturare ultimo punto pelle. Smettere di ventilazione isoflurano. </li><li> Monitorare ratto risveglio. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha regained coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. </li><li> Trattare rat ogni 8 ore per 24 ore con un analgesico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip), e con un antibiotico (una dose singola di duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico, i ratti casa individualmente fino al momento del sacrificio, cioè, 3 giorni dopo l&#39;MI. </li><li> Infartuale, principalmente necrosi, è espressa come percentuale di tessuto infartuato nella zona a rischio del ventricolo sinistro. Questo può misurato con trifeniltetrazolio colorazione 11. </li></ol> 2. Amygdala Isolamento <ol><li> Mettere la testa di animale prima in una borsa a forma di cono, con il suo naso sporgente dell&#39;apertura estremità più stretta. Ratto sicura per evitare qualsiasi movimento. Posizionare la testa in modo appropriato sulla ghigliottina, tra le lame delle forbici. Decapitate animale. </li><li> Inserire la testa del topo in un piatto tenuta in ghiaccio tritato. Eseguire tutte le procedure per l&#39;isolamento dei tessuti su ghiaccio tritato (4 ° C). </li><li> Tagliare sk apertoull con le forbici, staccare con cura guaine ossei con Rongeurs osso tirando ed evitando mutilare il tessuto sottostante. </li><li> Posizionare la lama piatta di una spatola tra il fondo del cranio e la superficie ventrale posteriore del cervello e staccare accuratamente cervello dai cranio spingendo delicatamente la lama in avanti lungo la parte inferiore del cranio, fino al cervello può essere lentamente sollevato dal cranio. Eliminare il cranio. </li><li> Posizionare cervello sulla sua superficie dorsale. Identificare ipotalamo (struttura di fronte cervelletto) e tagliare il cervello coronale di fronte alla sua estremità anteriore e dietro la sua estremità posteriore; scartare le parti anteriore e posteriore del cervello se non necessario per altri usi. </li><li> Visualizza le amigdale come piccole sfere di sotto dei lobi temporali, a livello bilaterale, proprio accanto l&#39;ipotalamo. </li><li> Capovolgere il piano cervello alla sua estremità anteriore, superficie dorsale dalla sperimentatore. </li><li> Inizia con il lato sinistro o destro del cervello. Separare la emisfere e quindi la corteccia dal amigdala contigua. Tagliare modo circa 8 mm di questa corteccia sciolto per consentire l&#39;isolamento dell&#39;amigdala. Tagliare amigdala con bisturi. </li><li> Isolare la parte basolaterale dell&#39;amigdala dalla sua parte centromedial tagliando lungo la sutura scura che l&#39;attraversa, quasi metà e metà. Questa struttura non è sempre facilmente identificabili. </li><li> Mettere sottoparti amigdala in fiale identificati separati e tenere su ghiaccio tritato. </li><li> Procedura dissezione Ripeti con l&#39;altro emisfero. </li><li> Immergere le fiale in azoto liquido per 1 min. Tenere fiala in -80 ° C freezer fino al momento. </li></ol> 3. caspasi-3 Attività <ol><li> Preparare tampone di lisi con 0,32 M di saccarosio, 1% Triton-X-100, 10 mM di Tris-HCl, pH 8, 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico, 2 mM di ditiotreitolo, 1 mM di fluoruro phenylmethylsulfonyl, 10 mg / mL di leupeptina , 10 mg / mL di pepstatina A e 10 mg / mL di aprotinina. </li><li>Aggiungere 150 ml di tampone di lisi per ogni campione (5-10 mg). Continuate a ghiaccio. Sonicare ogni campione in ghiaccio per 5 secondi a massima intensità (40 W). Incubare tessuto in tampone di lisi in ghiaccio per 30 min. Vortex ogni campione per 5 min. </li><li> Eseguire 3 cicli di congelamento / scongelamento collocando alternativamente campioni in azoto liquido e su una piastra di riscaldamento termostatato a 37 ° C. Tessuto Centrifugare a 13.000 g (4 ° C) per 10 min. Rimuovere con attenzione il surnatante e tenere in provetta su ghiaccio. </li><li> Preparare concentrazioni di proteine ​​standard tra 0 e 10 ug / ml con albumina di siero bovino. Preparare spazi vuoti con il solo tampone. </li><li> Aggiungere 200 ml di Bradford reagente ogni standard. Leggi di serie a 595 nm. Per livelli di proteine, aggiungere 5 ml di campione surnatante a 795 ml di acqua distillata e 200 ml di Bradford reagente. Leggi ogni campione a 595 nm e quantificare proteina con curva standard. </li><li> Preparare tampone di reazione con 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM di glicole etilenico tetraacetico, 0,1% di 3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate e 1 mM di ditiotreitolo. </li><li> Aggiungere 25 mg di proteine ​​di tampone di reazione e caspasi-3 substrati per ottenere campioni reattivi positivi e negativi. Per i campioni negativi, aggiungere tampone di reazione, 25 mg di proteine, 0,4 ml di Ac-DEVD-CHO 800 micron e 0,8 ml di Ac-DEVD-AMC 10 mm. Per i campioni positivi, aggiungere 25 mg di proteina per tampone di reazione e 0,8 ml di Ac-DEVD-AMC 10 mm. Elaborare tutti i campioni negativi e positivi in ​​triplice copia. Completare il volume finale di ciascun campione fino a 200 ml aggiungendo tampone di reazione. </li><li> Produrre controlli negativi con l&#39;aggiunta di 188,7 ml di buffer di reazione a 0,5 l di Ac-DEVD-CHO 800 micron, 0,8 microlitri Ac-DEVD-AMC 10 mm e 10 ml di tampone di lisi. Per i controlli positivi, aggiungere 189.2 ml di tampone di reazione, 0,8 ml di Ac-DEVD-AMC 10 mm e 10 ml di tampone di lisi. </li><li> Incubare i campioni econtrolli al buio per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Arrestare reazione con 600 microlitri glicina 0,4 M e 0,4 M NaOH (pH 10) in ciascun campione e controllo. </li><li> Quantificare fluorescenza spettrofluorimetria a eccitazione lunghezza d&#39;onda di 365 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 465 nm. Aggiungere 2 ml di acqua distillata a reazione in cuvetta vetro. Leggi i controlli ei campioni per 10 secondi con 1 punto in ogni sec. </li><li> Quantificare attività specifica in ciascun campione: ((fluorescenza di campioni negativi meno fluorescenza dei campioni positivi) x il volume di 2,8 ml) diviso per (tempo di incubazione 3 ore x quantità di proteine ​​25 mg). </li></ol>

<ol>
	<li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases:+keys+in+the+ignition+of+cell+death.">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li><li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors:+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway.">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala.">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li><li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li><li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R., Lakshmanadoss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19,+Post-Myocardial+Infarction+Depression.">Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression.</a> Novel Strategies in Ischemic Heart Disease . , 333-362 (2012).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat.">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li><li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model.">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li><li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression.">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li><li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction.">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li><li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion.">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li><li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolvin+D1,+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid,+decreases+post-myocardial+infarct+depression.">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li><li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction:+effects+of+sertraline.">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, 451-459 (2009).</li><li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+re-visited:+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues.">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li><li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Killing+the+blues':+a+role+for+cellular+suicide+(apoptosis)+in+depression+and+the+antidepressant+response.">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+pathways:+paper+wraps+stone+blunts+scissors.">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La nostra esperienza con questo protocollo nel corso degli ultimi 10 anni ha portato all&#39;identificazione di questioni metodologiche critiche. Innanzitutto, rapida dissezione cervello in piastre di Petri su ghiaccio tritato è importante per mantenere la qualità di preparazione. In secondo luogo, si deve tener presente che il tessuto è più breve sonicazione per l&#39;amigdala cerebrale rispetto ad altri tipi di tessuti, quali il cuore (10 sec) o reni (20 sec). In terzo luogo, grande attenzione deve prestare attenzione a miscelare con cura il substrato prima di aggiungerlo ai campioni. Abbiamo incontrato i segnali variabili quando la sequenza di miscelazione è stata inadeguata. Quarto, nessun bolle devono essere presenti nella cella di quarzo durante la lettura dei campioni. Altrimenti, il segnale potrebbe essere alterata. Abbiamo fatto un cambiamento negli ultimi anni per aumentare la riproducibilità dei risultati: crescente volume del substrato per evitare volume inferiore 1 ml. Ancora, possono verificarsi piccole variazioni tra dosaggi successivi, e almeno 3 campioni di controllo devono essere utilizzati perControllo per le variazioni. Misure di fluorescenza di questi controlli viene calcolata la media e la media è fissato a 100%. Misure di fluorescenza in campioni sperimentali sono trasformati in percentuale dei campioni di controllo. Un&#39;altra limitazione della tecnica è che viene utilizzata solo una parte di tessuto e, quindi, della caspasi-3 attività potrebbe essere sottostimato. Infatti, la finestra temporale di apoptosi è breve in qualsiasi data cellula e potrebbe mancare anche se si verifica nelle zone limitrofe al momento del campionamento 1,4,15. L&#39;inverso è anche possibile: apoptosi potrebbe essere particolarmente intensa in porzioni di tessuto, con conseguente sovrastima della caspasi-3 attività. Si consiglia l&#39;uso di tessuti rimanenti (amigdala) per le tecniche complementari, come test TUNEL o il rapporto Bax / Bcl2 (vedi introduzione). Spettrofluorimetria ha almeno due vantaggi rispetto Western blotting. Innanzitutto, esso genera direttamente dati quantitativi. In secondo luogo, una misura enzimaticactivity se piuttosto che proteine ​​o RNA espressione, che può essere correlato, ed è noto che l&#39;espressione della proteina può essere aumentata senza alcun cambiamento di attività enzimatica. Inoltre, spettrofluorimetria può essere eseguita su altri tessuti o con differenti specie animali e può essere regolato per altri sottotipi caspasi, con differenti substrati, tale che i confronti sicurezza può essere fatto. In conclusione, questo documento illustra l&#39;utilizzo di spettrofluorimetria per misurare caspasi-3 attività dell&#39;amigdala, fornendo prove che l&#39;apoptosi si verifica in questa regione del sistema limbic 3 giorni dopo MI.

Caspasi o proteasi aspartato-diretto cisteina-dipendenti sono una famiglia di enzimi che sono coinvolti in vari omeostasi processess 1. Caspasi possono essere classificati in base ai loro ruoli in apoptosi o infiammazione. Caspase-1, -4, -5 e -12 sono coinvolte nel processo infiammatorio, mentre coloro che sono impegnati in apoptosi può essere sotto-classificate come caspasi iniziatrici (caspasi-8 e -9) e caspasi boia (caspasi-3, -6 e -7 ). Caspasi svolgono ruoli significativi in ​​molte patologie, soprattutto nei disordini in cui l&#39;apoptosi può essere eccessivo, come osservato dopo infarto miocardico (IM) o ischemia cerebrale. Nel modello murino di sindrome post-MI utilizzata nel nostro laboratorio, è accertato che si attiva caspasi-3, non solo nel miocardio 2, ma anche nel sistema limbico, che è implicato nel controllo dell&#39;umore e le emozioni 3-6. Si è anche visto che è attivato caspasi-3 in diverse regionidel sistema limbic, come l&#39;amigdala e ippocampo, e questa attivazione picchi intorno 3 giorni dopo insulto ischemico 4. È interessante notare che, caspasi-3 attività si correla con i danni comportamentali post-MI, e la sua attenuazione attraverso interventi farmacologici e nutrizionali riduce queste lesioni, suggerendo un possibile legame tra caspasi-3 e post-MI depressione 7-12. Caspasi-3 attivazione può essere misurata mediante varie tecniche. Western blotting accerta le proprietà enzimatiche delle caspasi e può rilevare enzimi attivi e le loro forme pro-enzima. Western blotting, tuttavia, è semi-quantitativo, e piccole variazioni può essere perso attraverso rapporti deboli segnale-rumore 13. Una tecnica migliore è basato sulla scissione di un substrato (DEVD-AMC) di caspasi-3 che rilascia un composto fluorogenica e può essere misurata mediante spettrofluorimetria. Caspasi-3 attivazione è un indicatore affidabile di apoptosi. Misura di apoptosi can instabile perché la finestra di tempo di occorrenza è breve, e le cellule confinanti possono fagocitare corpi apoptotici o celle 14. L&#39;apoptosi può essere ulteriormente confermata da altre tecniche, come Terminal deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL) test, che rileva la frammentazione del DNA risultante da cascate apoptotici segnalazione 6, o il rapporto di proteine ​​pro / anti-apoptotico, come Bax / Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

Infarto del miocardio (MI) ha drammatiche a medio e lungo termine conseguenze a livello fisiologici e comportamentali, ma i meccanismi coinvolti sono ancora poco chiari. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello murino di sindrome post-MI che visualizza ridotta funzionalità cardiaca, perdita neuronale nel sistema limbico, deficit cognitivi e segni comportamentali di depressione. A livello neuronale, caspasi-3 attivazione media post-MI apoptosi in diverse regioni limbiche, come l&#39;amigdala - picco di 3 giorni post-MI. Disturbi cognitivi e comportamentali compaiono 2-3 settimane post-MI e questi correlazione statisticamente con misure di caspasi-3 attività. Il protocollo qui descritto è usato per indurre MI, raccogliere tessuti dell&#39;amigdala e misurare caspasi-3 attività utilizzando spettrofluorimetria. Per indurre MI, la coronaria discendente è occlusa per 40 min. Il protocollo per la valutazione della caspasi-3 attivazione inizia 3 giorni dopo MI: i ratti vengono sacrificati e l&#39;amigdala isolato RAPIDLY dal cervello. I campioni vengono congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino all&#39;analisi attuale. La tecnica eseguita per valutare l&#39;attivazione della caspasi-3 è basato sulla scissione di un substrato (DEVD-AMC) di caspasi-3, che rilascia un composto fluorogenica che può essere misurata mediante spettrofluorimetria. La metodologia è quantitativa e riproducibile ma l&#39;attrezzatura necessaria è costosa e la procedura per quantificare i campioni richiede tempo. Questa tecnica può essere applicata ad altri tessuti, quali il cuore e reni. DEVD-AMC può essere sostituito da altri substrati per misurare l&#39;attività di altre caspasi.

L&#39;amigdala è stato isolato in 8 sham (controllo) e 8 MI ratti tre giorni dopo l&#39;induzione del protocollo ischemia / riperfusione. Caspasi-3 è stata misurata l&#39;attività in questo tessuto utilizzando un fluorocromo che può essere scisso dalla caspasi-3 attiva e rilevato da spettrofluorimetria. Misure positive e negative (vedere i passi 3.11, 3.12 e 3.16) sono stati eseguiti in triplice copia e misurate durante 10 secondi, con 1 punto in ogni sec. Differenze tra controlli positivi e negativi sono stati calcolati e la media delle differenze per tutti i tessuti sham eseguita durante questo esperimento è stato fissato a 100%. I risultati di ratti MI sono stati regolati secondo questo riferimento e Figura 1 illustra i risultati finali: indica un&#39;attività significativamente maggiore nei ratti MI rispetto a sham (p &lt;0,05). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figura 1. Caspase-3attività dell&#39;amigdala di ratti MI, espresso come percentuale dell&#39;attività media nei controlli farsa, impostato a 100% (8 ratti per gruppo). * Indica una differenza significativa tra i gruppi (p &lt;0,05). I dati sono espressi come media ± SEM.

Watch this Scientific Journal Video about Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction at JoVE.com

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Caspasi-3 L&#39;attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Views.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

Video: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Infarto acuto del miocardio in topi

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Ricerca

Medicina

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochimica

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

Quantificazione istologica di cronica Myocardial Infarto in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

<meta charset="utf8"></head><body>Un nuovo modello di insufficienza cardiaca post-infarto del miocardio nel ratto

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

Un nuovo modello di insufficienza cardiaca post-infarto del miocardio nel ratto

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

<meta charset="utf8"></head><body>Un modello sperimentale di infarto del miocardio per lo studio della riparazione e del rimodellamento cardiaco nei topi knockout

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

Un modello sperimentale di infarto del miocardio per lo studio della riparazione e del rimodellamento cardiaco nei topi knockout

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

Caspasi-3 L'attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

Riepilogo

Esplora Altri Video

Infarto acuto del miocardio in topi

Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

Quantificazione istologica di cronica Myocardial Infarto in Rats

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Un nuovo modello di insufficienza cardiaca post-infarto del miocardio nel ratto

Un nuovo modello di insufficienza cardiaca post-infarto del miocardio nel ratto

Un modello di roditore ischemico del pericardio intatto

Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Un test di fluorescenza per valutare la permeabilità di una barriera endoteliale microvascolare cardiaca in un modello di ischemia/riperfusione di ratto

Un modello sperimentale di infarto del miocardio per lo studio della riparazione e del rimodellamento cardiaco nei topi knockout