. 상테 -이 작품은 자연 과학 및 캐나다 김 길버트 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡에서 재학를 보유하고있다.

동물은 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인에 따라, 지역 동물 관리위원회의 규정을 준수하여 처리됩니다. 쥐 (21 ~ 22 ºC의 온도 40-50 %에 습도) 개별적으로 일정 조건 하에서 보관되어 08:00에 시작, 12 시간 어두운 조명주기를 포함. 차우 펠릿 및 수돗물은 연구 전반에 걸쳐 사용할 수 임의로 있습니다. 공급자의 납품 후 3 일의 적응 기간은 실험 전에 허용됩니다. 300-800g 사이의 무게 수컷 흰쥐 일상적 프로토콜이 사용되어왔다. 1. MI 수술 <ol><li> 케타민 60 ㎎ / ㎏과 자일 라진 (10) ㎎ / ㎏의 복강 내 주사와 마취를 유도한다. 발을 슬쩍 할 때 반사의 부재로 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 수술 부위를 면도. (16G 1.77 인치) 카테터 및 측와위에서 동물을 배치 : 기관 내 튜브와 쥐를 삽관. 온도를 약 37 ℃를 유지하기 위해 가열 패드에 동물을 놓습니다. 2 % 이소 플루 란 할 수있는 기관 내 튜브를 연결합니다. </li><li> 클로르헥시딘 글루 콘 이소 프로필 알코올로 수술 부위를 준비합니다. 수술하는 동안, 멸균 장갑 멸균 악기를 사용합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용합니다. 동물과 동물 옆에 또 다른 무균 필드에 악기 멸균 필드를 넣습니다. </li><li> 메스 블레이드 # 10 피부를 절개. 지혈 클램프와 근육 조직을 벗겨. 복부 욕창 위치에있는 동물을 놓습니다. 지혈 클램프와 위치 가슴 트랙터 오픈 흉부 벽. 지혈 클램프 열기 심낭. </li><li> 연속 된 심근 조직을 통과, 관상 동맥 폐색, 루프에게 하행 관상 동맥 주위에 360mm 길이의 4-0 실크 봉합사를 생산합니다. 14G, 1.25 cm 긴 플라스틱 관에 실크 봉합사의 양쪽 끝을 삽입합니다. </li><li> 실크 봉합사와 고름의 양쪽 끝을 잡아 당겨시간은 아래 동맥에 튜브는 40 분 동안을 폐색한다. 지혈 클램프 플라스틱 튜브를 체결하여 안전 폐색. </li><li> 40 분 후,가요 성 배관 및 실크 봉합사를 제거하여 지혈 클램프를 해제함으로써 폐색을 해제. 주 : 샴 대조군은 동일한 수술 마이너스 관상 동맥 폐색을 겪는다. </li><li> 흉부 벽을 닫기 전에, 기흉을 방지하기 위해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그릴 흉강을 통해 유연한 카테터 (18G, 4.5 CM)를 배치합니다. </li><li> 닫기 흉부 공동은 2-0 봉합사로, 4-0 실크 봉합사로 근육과 3-0 실크 봉합사로 피부 만들기. </li><li> 마지막으로 피부 지점을 닫기 전에 다시 흉부 캐비티 이전에 배치 카테터를 통해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그립니다. </li><li> 마지막으로 피부에 포인트를 봉합. 이소 플루 란 환기를 중지합니다. </li><li> 쥐의 각성을 모니터링합니다. 이 regaine을 가질 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오D 충분한 의식은 흉골 드러 누움을 유지합니다. </li><li> 항생제와 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.05 ㎎ / ㎏ IP)과 24 시간 (duplocillin의 단일 용량, 0.2 ㎎ / ㎏ IP)에 대한 쥐에게 매일 8 시간을 취급합니다. </li><li> 수술 후, 집 쥐 개별적으로 즉 희생의 시간까지 3 일 후 MI. </li><li> 경색 크기 주로 괴사는 좌심실의 위험 지역에서 경색 된 조직의 비율로서 표현된다. 이는 트리 페닐 착색 (11)를 이용하여 측정 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 편도 격리 <ol><li> 코가 좁은 끝 구멍 밖으로 돌출, 원뿔 모양의 가방에 먼저 동물 머리를 놓습니다. 보안 쥐 움직임을 방지 할 수 있습니다. 가위 블레이드 사이에, 단두대에 적절하게 머리를 놓습니다. 동물의 목을 벨. </li><li> 접시에 쥐 장소 머리가 짓 눌린 얼음에 보관. 얼음 조각 (4 ℃로)에 조직 분리를위한 모든 절차를 수행합니다. </li><li> 잘라 열린 SKULL 가위로 조심스럽게 잡아 당겨과 아래 조직을 토막 피함으로써 뼈 rongeurs과 뼈 덮개를 분리합니다. </li><li> 두개골의 바닥과 뇌의 후방 복부 표면 사이의 주걱의 플랫 블레이드를 놓고 조심스럽게 뇌가 천천히 올라 해제 될 때까지 부드럽게 두개골의 바닥을 따라 앞으로 블레이드를 밀어 두개골에서 뇌를 분리 두개골. 두개골을 폐기하십시오. </li><li> 는 등의 표면에 두뇌를 놓습니다. 시상 하부 (소뇌의 앞에 구조)를 확인하고 그 앞쪽 끝과 후방 끝 뒤에 앞에 coronally 뇌를 잘라; 다른 용도로 필요하지 않은 경우 뇌의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 폐기합니다. </li><li> 바로 옆에있는 시상 하부에, 좌우, 측두엽 아래에 작은 구체로 amygdalas을 시각화. </li><li> 멀리 실험에서, 그 정면 끝 등의 표면을 뇌 플랫 플립. </li><li> 뇌의 왼쪽 또는 오른쪽으로 시작합니다. 헤미을 분리다음 분야와 인접 편도체의 피질. 편도의 분리를 허용하려면이 느슨한 피질의 방법에 대한 8mm를 잘라. 메스와 편도체를 버려야. </li><li> 그것을 통해 실행하는 어두운 봉합, 거의 절반의 절반을 따라 절단하여 centromedial 부분에서 편도의 기저 부분을 분리합니다. 이 구조는 항상 쉽게 식별 아니다. </li><li> 별도의 확인 된 유리 병에 편도체의 하위 부분을 넣고 짓 눌린 된 얼음에 보관하십시오. </li><li> 다른 반구와 반복 해부 절차. </li><li> 1 분 동안 액체 질소에 튜브를 담근다. 필요할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 병을 보관하십시오. </li></ol> 3. 카스파 제 3 활동 <ol><li> 수크로오스 0.32 M, 1 % 트리톤 X-100, 트리스 -HCl, pH가 8, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 5 mm의 디티 오 트레이 톨의 2 mm의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드로부터 1mm, 류 펩틴 10 μg의 μL / 10 mm의 용해 완충액을 제조 , 펩 스타틴 A의 10 μg의 / μL과 아프로 티닌의 10 μg의 / μL. </li><li>각 샘플 (5-10 mg)을에 용해 버퍼 150 μl를 추가합니다. 얼음에 보관하십시오. 최대 강도 (40 W)에서 5 초 동안 얼음에 각각의 샘플을 초음파 처리. 30 분 동안 얼음에서 용해 완충액에서 조직을 배양한다. 와류에서 5 분 동안 각각의 샘플. </li><li> 교대 액체 질소에서 37 ° C로 설정 자동 온도 제어 가열판에 샘플을 놓고 3 냉동 / 해동 사이클을 수행한다. 13,000g에서 원심 분리기 조직 (4 10 분 동안 ° C). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 유지. </li><li> 소 혈청 알부민으로 0 및 10 ㎍ / ml이다 표준 단백질 농도를 준비한다. 전용 버퍼 공백을 준비합니다. </li><li> 각 표준에 브래드 포드 시약 200 μl를 추가합니다. 595 nm에서 표준 읽기. 단백질 수준, 증류수 795 μL 및 브래드 포드 시약 200 μL를 샘플의 상등액 5 μL를 추가한다. 595 nm에서 각각의 샘플을 읽고 표준 곡선과 단백질을 정량화. </li><li> 5 밀리미터의 MgCl 2에 50 mM Tris-HCl, pH 7, &lt;와 반응 완충액을 제조/ 서브&gt;, 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산의 1 mm의 3 0.1 % cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 디티 오 트레이 톨 및 1 mm이다. </li><li> 양성 및 음성 반응 샘플들을 획득하기 위해 반응 완충액 및 카스파 제 -3 기질에 25 μg의 단백질을 추가한다. 음의 샘플은, 단백질 25 μg의, AC-DEVD 초 800 μm의 0.4 μL와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL, 반응 버퍼를 추가합니다. 긍정적 인 샘플의 경우, 반응 버퍼에 단백질 25 μg의와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μl를 추가합니다. 세중의 모든 부정과 긍정적 인 샘플을 처리합니다. 반응 버퍼를 추가하여 200 μL까지 각 샘플의 최종 부피를 완료합니다. </li><li> AC-DEVD-CHO 800 μM, 0.5 μL, 0.8 μL AC-DEVD-AMC 10 mM 내지 용해 완충액 10 μL에 반응 완충액 중 188.7 μl를 첨가함으로써 네거티브 컨트롤을 생성한다. 양성 대조군의 경우, 반응 버퍼의 189.2 μL, AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL 및 용해 버퍼의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 샘플을 품어37 O ℃에서 3 시간 동안 어둠 속에서 컨트롤 </li><li> 각 샘플 및 제어에 600 μL 글리신 0.4 M NaOH를 0.4 M (PH 10)과의 반응을 중지합니다. </li><li> 465 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장에 의해 형광 spectrofluorometry 정량화. 유리 큐벳의 반응에 증류수 2 ㎖를 추가합니다. 각 초에 1 포인트 10 초 동안 제어 및 샘플을 참조하십시오. </li><li> 각 샘플의 특정 활동을 정량화 : ((음 샘플 마이너스 긍정적 인 샘플의 형광) 2.8 ml를 X 볼륨의 형광) (단백질 25 mg을 배양 3 시간의 X 양의 시간)으로 나눈 값입니다. </li></ol>

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</ol>

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지난 10 년 동안이 프로토콜을 사용하여 우리의 경험은 중요한 방법 론적 문제의 식별되었다. 첫째, 짓 눌린 된 얼음에 페트리 접시에 빠른 뇌 해부 준비 품질을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 조직은 초음파 등의 심장 (10 초)과 같은 조직의 유형, 또는 신장 (20 초)에 비해 뇌에 대한 편도체 짧다고 실현되어야한다. 셋째, 큰 관심을 신중 샘플에 추가하기 전에, 기판을 혼합주의해야한다. 혼합 순서가 불충분 한 때 우리는 변수 신호가 발생했습니다. 샘플을 판독 할 때 제, 기포는 석영 셀에 존재할 수 없어야한다. 그렇지 않으면, 신호가 변경 될 수있다. 1 μL 미만의 체적을 피하기 위해 기판 ​​부피가 증가 : 우리는 결과의 재현성을 높이기 위해 지난 몇 년 동안 변화했다. 여전히 작은 변화는 연속 분석법 사이에서 발생할 수 있고, 적어도 3 개의 시료를 제어하는​​ 데 사용되어야변화를 제어 할 수 있습니다. 이러한 컨트롤 형광 측정 평균화하고, 평균 100 %로 설정된다. 실험 샘플의 형광 측정은 대조 시료의 퍼센트로 변환된다. 기술의 또 다른 한계는 따라서, 카스파 제 -3 활성을 과소 평가 될 수있는 조직의 일부만이 사용되도록하고. 실제로, 아폽토시스의 시간 윈도우는 임의의 주어진 셀 짧게 중이며 1,4,15 샘플링시의 인접 지역에서 발생하더라도 누락 될 수있다. 반대의 경우도 가능하다 : 세포 사멸은 카스파 제 -3 활동의 과대 평가 결과, 조직의 부분에서 특히 강렬한 될 수 있습니다. 우리는 TUNEL 분석 또는 Bax의 /에서 Bcl2 비율 (소개를 참조하십시오)와 같은 보완적인 기술에 대한 잔여 조직 (편도)의 사용을 권장합니다. Spectrofluorometry 웨스턴 블로 팅을 통해 적어도 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 직접 정량 데이터를 생성한다. 둘째, 효소를 측정ctivity 자체보다는 무관 할 수 있으며,이 단백질의 발현은 효소 활성의 변화없이 증가 할 수 있음을 공지 된 단백질 또는 RNA 발현. 또한, spectrofluorometry는 다른 조직 또는 다른 동물 종으로 수행 될 수 있고, 다른 기판에, 다른 카스파 아형에 대해 조절 될 수 있으므로, 그 비교는 안전 할 수있다. 결론적으로,이 문서는 세포 사멸 3 일 심근 경색 후 변연계의이 지역에서 발생하는 증거를 제공하는 편도체에서 카스파 제 -3 활성을 측정하는 spectrofluorometry을 사용하는 방법을 보여줍니다.

카스파 또는 시스테인 의존 아스 파르 테이트 지시 단백질 분해 효소는 다양한 항상성 processess 1에 관여하는 효소의 가족입니다. 카스파는 크게 아폽토시스 또는 염증의 역할에 따라 분류 될 수있다. 카스파-1, -4, -5 -12가 세포 사멸에 종사하는 사람들이있을 수있는 반면 염증에 관여하는 하위 분류 기자 카스파​​로 (카스파 제 8 -9)와 사형 집행 인의 카스파 (카스파 제 -3, -6 및 -7 ). 심근 경색 (MI) 또는 뇌허혈 후 관찰 카스파는 주로 세포 사멸이 과도 할 수있다 질환에 많은 병리에 중요한 역할을한다. 우리의 실험에 사용 된 후 MI 증후군의 쥐 모델에서, 카스파 제 -3은 심근 2뿐만 아니라 분위기 3-6과 감정의 제어에 연루되는 변연계에서뿐만 아니라 활성화되어 있음을 수립한다. 또한, 카스파 제 -3은 상이한 영역에서 활성화되는 것을 알 수있다변연계의 같은 편도체와 해마, 허혈성 모욕 4 후 3 일 주변이 활성화 피크로. 흥미롭게도, 카스파 제 -3 활성은 MI 후 행동 장애와 상관 관계 및 약리 및 영양 개입을 통해 감쇠는 카스파 제 -3 및 사후 MI 우울증 7-12 사이의 가능한 링크를 제안,이 부상을 줄일 수 있습니다. 카스파 제 -3 활성은 다양한 기법에 의해 측정 될 수있다. 웨스턴 블 롯팅은 카스파의 특성을 파악한 후 효소 활성 효소뿐만 아니라 프로 효소 형태를 검출 할 수있다. 웨스턴 블 롯팅은, 그러나, 반 정량적이고, 작은 변화는 약한 신호 - 대 - 잡음 비율 (13)을 통해 손실 될 수있다. 더 나은 기술이 형광 화합물을 해제하고 spectrofluorometry 의해 측정 될 수 카스파 제 (3)에 의한 기판 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 카스파 제 -3 활성화는 세포 사멸의 신뢰할 수있는 마커입니다. 세포 사멸의 CA의 측정N의 발생 시간 윈도우가 짧기 때문에 불안정하고, 인접 셀은 세포 자멸 소체 세포 또는 14 phagocytize 있었다. 아폽토시스는 또한 이러한 백스 / 같이 사멸 시그널링 캐스케이드 (6), 또는 항 - 세포 사멸 / 프로 단백질의 비율에 의한 DNA 단편화를 검출하는 그러한 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석과 같은 다른 기술들에 의해 확인 될 수있다 BCL2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>with DeltaRAM&amp;nbsp; Random Access Monochromator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>small animal ventilation</td></tr><tr><td>Glass cuvette</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&amp;nbsp; series</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

심근 경색 (MI)는 생리적 및 행동 수준에서 극적인 중장기 결과를 초래하지만, 관련된 메카니즘은 여전히​​ 불명확하다. 우리 연구소는 장애 심장 기능, 변연계의 신경 세포 손실,인지 결핍과 우울증의 행동 징후를 표시 MI 후 증후군의 쥐 모델을 개발했다. MI 후 삼일에 뾰족 - 신경 세포 수준에서 카스파 제 -3 활성화는 편도와 같은 다른 변연 지역에서 포스트 MI의 세포 사멸을 매개. 인지 및 행동 장애는 2-3주에게 포스트 MI를 표시하고 이러한 카스파 제 -3 활성의 조치를 통계적으로 상관 관계. 여기에 설명 된 프로토콜은 MI를 유도 편도 조직을 수집하고 spectrofluorometry를 사용 카스파 제 -3 활성을 측정하기 위해 사용된다. MI를 유도하기 위해, 하행 관상 동맥을 40 분간 폐색된다. 래트를 희생하고 편도선은 RAPI 격리 : 카스파 제 -3 활성의 평가를위한 프로토콜 3 일 후에 시작 MI뇌에서 DLY. 샘플은 신속하게 액체 질소에 냉동과 실제 분석 할 때까지 -80 ℃에서 보관됩니다. 카스파 제 -3 활성을 평가하기 위해 수행 spectrofluorometry 기법에 의해 측정 될 수있는 형광 화합물을 방출하여 카스파 제 -3 기질 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 방법론은 정량적 재현성하지만 필수 장비는 고가이고 샘플을 정량화하기위한 절차는 시간을 소모한다. 이 기술은 심장, 신장 같은 다른 조직에 적용될 수있다. DEVD-AMC 다른 카스파 제의 활성을 측정하기 위하여 다른 기판으로 대체 될 수있다.

편도 8 가짜 (제어) 및 삼일 허혈 / 재관류 프로토콜의 유도 후 8 MI 쥐에서 분리 하였다. 카스파 제 -3 활성은 활성 카스파 제 -3에 의해 절단하고 spectrofluorometry 의해 검출 될 수있는 형광 색소를 사용하여이 조직을 측정 하였다. 긍정과 부정 측정 (단계 3.11, 3.12 및 3.16 참조) 각 초에서 1 점으로, 10 초 동안 세중 수행하고 측정 하였다. 양성 및 음성 대조군의 차이를 산출하고,이 실험을 수행하는 동안 모든 조직에 대한 모의 차이의 평균을 100 %로 설정 하였다. MI 쥐의 결과는이 기준에 따라 조정하고, 그림 1은 최종 결과를 보여 그것은 가짜 (P &lt;0.05)에 비해 심근 경색 쥐에서 상당히 높은 활성을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> 도 1 카스파 제 -3MI 쥐의 편도체의 활동은, 100 % (그룹 당 8 쥐)로 설정, 가짜 컨트롤의 평균 활동의 백분율로 표시. * 상당한 집단 간 차이 (P &lt;0.05)를 나타냅니다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표현된다.

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K 조회수.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

비디오: Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

고양이에서 급성 심근 경색

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

연구

의학

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

생화학

Histological Quantification of Chronic Myocardial Infarct in Rats

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ischemic injury. Following the initial acute phase, chronic remodeling of the left ventricle (LV) modifies the structure and function of the heart. Permanent coronary ligation in small animals has been widely used as a reference model for a chronic model of MI. Thinning of the infarcted wall progressively develops to transmural fibrosis. Histological assessment of infarct size is commonly performed; nevertheless, a standardization of the methods for quantification is missing. Indeed, important methodological aspects, such as the number of sections analyzed and the sampling and quantification methods, are usually not described and therefore preclude comparison across investigations. Too often, quantification is performed on a single section obtained at the level of the papillary muscles. Because novel strategies aimed at reducing infarct expansion and remodeling are under investigation, there is an important need for the standardization of accurate heart sampling protocols. We describe an accurate method to quantify the infarct size using a systematic sampling of harvested rat heart and image analyses of trichromatic stained histological sections obtained from base to apex. We also provide evidence that calculating the expansion index (EI) allowed for infarct size assessment, taking into account changes of the left ventricle throughout the remodeling.

The post-mortem assessment of myocardial infarction (MI) in rodents is based on quantification of the infarct on stained heart sections. We describe an accurate method to quantify the infarct size using systematic sampling of harvested rat hearts from base to apex and image analyses of trichrome-stained histological sections.

쥐의 만성 심근 경색의 조직 학적 정량

Myocardial infarction is defined as cardiomyocyte death due to prolonged ischemia; an inflammatory response and scar formation (fibrosis) follow the ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A New Model of Heart Failure Post-Myocardial Infarction in the Rat

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial infarction (MI). However, the disadvantages of this model include high mortality rate after ligation and larger variations both in the infarct size and the degree of impaired cardiac function. In addition, a ventilator or exteriorization of the heart is indispensable for the previous models, which complicates the procedure during the ligation. In this study, we developed a reliable and reproducible model without the ventilator or exteriorization of the heart by ligating the LAD coronary artery. Four weeks after the procedure, we found that the serum concentrations of CK-MB, NT-proBNP, and Renin, which were used to assist diagnoses of MI and HF, were significantly higher in the MI group compared to the sham group. In contrast, the value of left ventricle ejection fraction (LVEF) in the MI group was obviously less than in the sham group. Furthermore, the infarct size and cardiac fibrosis area were individually confirmed and quantitatively analyzed by TTC staining and Masson's trichrome staining. Smaller variations were found in either infarct size or fibrosis area in the MI group, which helped to develop a reliable and reproducible model of HF post-MI. This new model of HF post-MI in the rat is vital for studying the potential mechanisms of MI and HF. This new method can be used to develop the new drug for treatment of MI and HF in rats by using pharmacological strategies.

<meta charset="utf8"></head><body>쥐의 심근 경색 후 심부전의 새로운 모델

We successfully developed a reliable and reproducible model of heart failure post-myocardial infarction in the rat without ventilation or exteriorization of the heart. This simplifies the procedure and benefits the further studies about the potential mechanisms behind the heart failure.

쥐의 심근 경색 후 심부전의 새로운 모델

Ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery has been widely used to establish the rat model of heart failure (HF) post myocardial ...

An Intact Pericardium Ischemic Rodent Model

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to induce myocardial injury). The majority of pre-clinical myocardial infarction models require the disruption of pericardial integrity with loss of the homeostatic cellular milieu. However, recently a methodology has been developed by us to induce myocardial infarction, which minimizes pericardial damage and retains the heart&#39;s resident immune cell population. An improved cardiac functional recovery in mice with an intact pericardial space following coronary ligation has been observed. This method provides an opportunity to study inflammatory responses in the pericardial space following myocardial infarction. Further development of the labeling techniques can be combined with this model to understand the fate and function of pericardial immune cells in regulating the inflammatory mechanisms that drive remodeling in the heart, including fibrosis.

This protocol outlines the steps for inducing myocardial infarction in mice while preserving the pericardium and its contents.

온전한 심낭 허혈성 설치류 모델

This protocol has shown that the pericardium and its contents play an essential anti-fibrotic role in the ischemic rodent model (coronary ligation to ...

A Fluorescence Assay for Evaluating the Permeability of a Cardiac Microvascular Endothelial Barrier in a Rat Model of Ischemia/reperfusion

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the best strategy for improving the clinical prognosis of patients with acute coronary syndrome (ACS). Nonetheless, myocardial reperfusion following effective revascularization can trigger significant cardiomyocyte death and coronary endothelial collapse, known as myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI). Usually, endothelial cells and their intercellular tight junctions cooperatively maintain the microvascular endothelial barrier and its relatively low permeability but fail in reperfusion areas. 
Microvascular endothelial hyperpermeability induced by ischemia/reperfusion (IR) contributes to myocardial edema, increased infiltration of pro-inflammatory cells, and aggravated intramyocardial hemorrhage, which may worsen the prognosis of ACS. The tracer used in this study-70,000 Da FITC-dextran, a branched glucose molecule labeled by fluorescein isothiocyanate (FITC)-appears too large to infiltrate the cardiac microvascular endothelium in normal conditions. However, it is capable of infiltrating a broken barrier after MIRI. Thus, the higher the endothelial permeability is, the more FITC-dextran accumulates in the extravascular intercellular space. Thus, the intensity of fluorescence from FITC can indicate the permeability of the microvascular endothelial barrier. This protocol takes advantage of FITC-dextran to evaluate the cardiac microvascular endothelial barrier functionally, which is detected by an automated quantitative pathology imaging system.

<meta charset="utf8"></head><body>허혈/재관류의 쥐 모델에서 심장 미세혈관 내피 장벽의 투과성을 평가하기 위한 형광 분석

Here, we describe a method to functionally assess the endothelial barrier of cardiac microvessels after ischemia/reperfusion injury via the measurement of the mean fluorescence intensity of extravasated 70,000 Da FITC-dextran in comparison with Evans Blue.

허혈/재관류의 쥐 모델에서 심장 미세혈관 내피 장벽의 투과성을 평가하기 위한 형광 분석

Revascularization therapies for culprit arteries, regardless of percutaneous coronary intervention and coronary artery bypass grafting, are considered the ...

An Experimental Model of Myocardial Infarction for Studying Cardiac Repair and Remodeling in Knockout Mice

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. This paper describes a protocol for studying the role of galectin 3 (Gal-3) in the temporal evolution of cardiac healing and remodeling in an experimental animal model of MI. 
The procedures described include an experimental model of MI with a permanent coronary ligature in male C57BL/6J (control) and Gal-3 knockout (KO) mice, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and systolic function in vivo, a histological evaluation of interstitial myocardial fibrosis with picrosirius red-stained and rhodamine-conjugated lectin-stained sections for studying myocyte hypertrophy by the cross-sectional area (MCSA), and the quantification of infarct size and cardiac remodeling (scar thinning, septum thickness, and expansion index) by planimetry in slices stained with Masson's trichrome and triphenyl tetrazolium chloride. Gal-3 KO mice with MI showed disrupted cardiac remodeling and an increase in the scar thinning ratio and the expansion index. At the onset of MI, myocardial function and cardiac remodeling were also severely affected. At 4 weeks post MI, the natural evolution of fibrosis in infarcted Gal-3 KO mice was also affected. 
In summary, the experimental model of MI is a suitable model for studying the temporal evolution of cardiac repair and remodeling in mice with the genetic deletion of Gal-3 and other animal models. The lack of Gal-3 affects the dynamics of cardiac repair and disrupts the evolution of cardiac remodeling and function after MI.

<meta charset="utf8"></head><body>녹아웃 마우스의 심장 수리 및 리모델링을 연구하기 위한 심근 경색의 실험적 모델

Here, we describe an experimental model of myocardial infarction, an echocardiography procedure to study cardiac remodeling and function, and procedures for quantifying fibrosis and hypertrophy in picrosirius red-stained and rhodamine-stained sections, as well as the infarct size and expansion index in slices stained with Masson's trichrome.

녹아웃 마우스의 심장 수리 및 리모델링을 연구하기 위한 심근 경색의 실험적 모델

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of death in Western countries, with acute myocardial infarction (MI) being the most prevalent form. ...

심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

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쥐의 심근 경색 후 심부전의 새로운 모델

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허혈/재관류의 쥐 모델에서 심장 미세혈관 내피 장벽의 투과성을 평가하기 위한 형광 분석

녹아웃 마우스의 심장 수리 및 리모델링을 연구하기 위한 심근 경색의 실험적 모델