. 상테 -이 작품은 자연 과학 및 캐나다 김 길버트 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다 퐁 드 라 공들인 뒤 퀘벡에서 재학를 보유하고있다.

동물은 동물 관리에 캐나다위원회의 가이드 라인에 따라, 지역 동물 관리위원회의 규정을 준수하여 처리됩니다. 쥐 (21 ~ 22 ºC의 온도 40-50 %에 습도) 개별적으로 일정 조건 하에서 보관되어 08:00에 시작, 12 시간 어두운 조명주기를 포함. 차우 펠릿 및 수돗물은 연구 전반에 걸쳐 사용할 수 임의로 있습니다. 공급자의 납품 후 3 일의 적응 기간은 실험 전에 허용됩니다. 300-800g 사이의 무게 수컷 흰쥐 일상적 프로토콜이 사용되어왔다. 1. MI 수술 <ol><li> 케타민 60 ㎎ / ㎏과 자일 라진 (10) ㎎ / ㎏의 복강 내 주사와 마취를 유도한다. 발을 슬쩍 할 때 반사의 부재로 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 수술 부위를 면도. (16G 1.77 인치) 카테터 및 측와위에서 동물을 배치 : 기관 내 튜브와 쥐를 삽관. 온도를 약 37 ℃를 유지하기 위해 가열 패드에 동물을 놓습니다. 2 % 이소 플루 란 할 수있는 기관 내 튜브를 연결합니다. </li><li> 클로르헥시딘 글루 콘 이소 프로필 알코올로 수술 부위를 준비합니다. 수술하는 동안, 멸균 장갑 멸균 악기를 사용합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 적용합니다. 동물과 동물 옆에 또 다른 무균 필드에 악기 멸균 필드를 넣습니다. </li><li> 메스 블레이드 # 10 피부를 절개. 지혈 클램프와 근육 조직을 벗겨. 복부 욕창 위치에있는 동물을 놓습니다. 지혈 클램프와 위치 가슴 트랙터 오픈 흉부 벽. 지혈 클램프 열기 심낭. </li><li> 연속 된 심근 조직을 통과, 관상 동맥 폐색, 루프에게 하행 관상 동맥 주위에 360mm 길이의 4-0 실크 봉합사를 생산합니다. 14G, 1.25 cm 긴 플라스틱 관에 실크 봉합사의 양쪽 끝을 삽입합니다. </li><li> 실크 봉합사와 고름의 양쪽 끝을 잡아 당겨시간은 아래 동맥에 튜브는 40 분 동안을 폐색한다. 지혈 클램프 플라스틱 튜브를 체결하여 안전 폐색. </li><li> 40 분 후,가요 성 배관 및 실크 봉합사를 제거하여 지혈 클램프를 해제함으로써 폐색을 해제. 주 : 샴 대조군은 동일한 수술 마이너스 관상 동맥 폐색을 겪는다. </li><li> 흉부 벽을 닫기 전에, 기흉을 방지하기 위해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그릴 흉강을 통해 유연한 카테터 (18G, 4.5 CM)를 배치합니다. </li><li> 닫기 흉부 공동은 2-0 봉합사로, 4-0 실크 봉합사로 근육과 3-0 실크 봉합사로 피부 만들기. </li><li> 마지막으로 피부 지점을 닫기 전에 다시 흉부 캐비티 이전에 배치 카테터를 통해 5 ML의 주사기와 흉부의 공기를 그립니다. </li><li> 마지막으로 피부에 포인트를 봉합. 이소 플루 란 환기를 중지합니다. </li><li> 쥐의 각성을 모니터링합니다. 이 regaine을 가질 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오D 충분한 의식은 흉골 드러 누움을 유지합니다. </li><li> 항생제와 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.05 ㎎ / ㎏ IP)과 24 시간 (duplocillin의 단일 용량, 0.2 ㎎ / ㎏ IP)에 대한 쥐에게 매일 8 시간을 취급합니다. </li><li> 수술 후, 집 쥐 개별적으로 즉 희생의 시간까지 3 일 후 MI. </li><li> 경색 크기 주로 괴사는 좌심실의 위험 지역에서 경색 된 조직의 비율로서 표현된다. 이는 트리 페닐 착색 (11)를 이용하여 측정 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 편도 격리 <ol><li> 코가 좁은 끝 구멍 밖으로 돌출, 원뿔 모양의 가방에 먼저 동물 머리를 놓습니다. 보안 쥐 움직임을 방지 할 수 있습니다. 가위 블레이드 사이에, 단두대에 적절하게 머리를 놓습니다. 동물의 목을 벨. </li><li> 접시에 쥐 장소 머리가 짓 눌린 얼음에 보관. 얼음 조각 (4 ℃로)에 조직 분리를위한 모든 절차를 수행합니다. </li><li> 잘라 열린 SKULL 가위로 조심스럽게 잡아 당겨과 아래 조직을 토막 피함으로써 뼈 rongeurs과 뼈 덮개를 분리합니다. </li><li> 두개골의 바닥과 뇌의 후방 복부 표면 사이의 주걱의 플랫 블레이드를 놓고 조심스럽게 뇌가 천천히 올라 해제 될 때까지 부드럽게 두개골의 바닥을 따라 앞으로 블레이드를 밀어 두개골에서 뇌를 분리 두개골. 두개골을 폐기하십시오. </li><li> 는 등의 표면에 두뇌를 놓습니다. 시상 하부 (소뇌의 앞에 구조)를 확인하고 그 앞쪽 끝과 후방 끝 뒤에 앞에 coronally 뇌를 잘라; 다른 용도로 필요하지 않은 경우 뇌의 앞쪽과 뒤쪽 부분을 폐기합니다. </li><li> 바로 옆에있는 시상 하부에, 좌우, 측두엽 아래에 작은 구체로 amygdalas을 시각화. </li><li> 멀리 실험에서, 그 정면 끝 등의 표면을 뇌 플랫 플립. </li><li> 뇌의 왼쪽 또는 오른쪽으로 시작합니다. 헤미을 분리다음 분야와 인접 편도체의 피질. 편도의 분리를 허용하려면이 느슨한 피질의 방법에 대한 8mm를 잘라. 메스와 편도체를 버려야. </li><li> 그것을 통해 실행하는 어두운 봉합, 거의 절반의 절반을 따라 절단하여 centromedial 부분에서 편도의 기저 부분을 분리합니다. 이 구조는 항상 쉽게 식별 아니다. </li><li> 별도의 확인 된 유리 병에 편도체의 하위 부분을 넣고 짓 눌린 된 얼음에 보관하십시오. </li><li> 다른 반구와 반복 해부 절차. </li><li> 1 분 동안 액체 질소에 튜브를 담근다. 필요할 때까지 -80 ° C의 냉동고에 병을 보관하십시오. </li></ol> 3. 카스파 제 3 활동 <ol><li> 수크로오스 0.32 M, 1 % 트리톤 X-100, 트리스 -HCl, pH가 8, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산의 5 mm의 디티 오 트레이 톨의 2 mm의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드로부터 1mm, 류 펩틴 10 μg의 μL / 10 mm의 용해 완충액을 제조 , 펩 스타틴 A의 10 μg의 / μL과 아프로 티닌의 10 μg의 / μL. </li><li>각 샘플 (5-10 mg)을에 용해 버퍼 150 μl를 추가합니다. 얼음에 보관하십시오. 최대 강도 (40 W)에서 5 초 동안 얼음에 각각의 샘플을 초음파 처리. 30 분 동안 얼음에서 용해 완충액에서 조직을 배양한다. 와류에서 5 분 동안 각각의 샘플. </li><li> 교대 액체 질소에서 37 ° C로 설정 자동 온도 제어 가열판에 샘플을 놓고 3 냉동 / 해동 사이클을 수행한다. 13,000g에서 원심 분리기 조직 (4 10 분 동안 ° C). 조심스럽게 상층 액을 제거하고 얼음에 튜브를 유지. </li><li> 소 혈청 알부민으로 0 및 10 ㎍ / ml이다 표준 단백질 농도를 준비한다. 전용 버퍼 공백을 준비합니다. </li><li> 각 표준에 브래드 포드 시약 200 μl를 추가합니다. 595 nm에서 표준 읽기. 단백질 수준, 증류수 795 μL 및 브래드 포드 시약 200 μL를 샘플의 상등액 5 μL를 추가한다. 595 nm에서 각각의 샘플을 읽고 표준 곡선과 단백질을 정량화. </li><li> 5 밀리미터의 MgCl 2에 50 mM Tris-HCl, pH 7, &lt;와 반응 완충액을 제조/ 서브&gt;, 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산의 1 mm의 3 0.1 % cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 디티 오 트레이 톨 및 1 mm이다. </li><li> 양성 및 음성 반응 샘플들을 획득하기 위해 반응 완충액 및 카스파 제 -3 기질에 25 μg의 단백질을 추가한다. 음의 샘플은, 단백질 25 μg의, AC-DEVD 초 800 μm의 0.4 μL와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL, 반응 버퍼를 추가합니다. 긍정적 인 샘플의 경우, 반응 버퍼에 단백질 25 μg의와 AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μl를 추가합니다. 세중의 모든 부정과 긍정적 인 샘플을 처리합니다. 반응 버퍼를 추가하여 200 μL까지 각 샘플의 최종 부피를 완료합니다. </li><li> AC-DEVD-CHO 800 μM, 0.5 μL, 0.8 μL AC-DEVD-AMC 10 mM 내지 용해 완충액 10 μL에 반응 완충액 중 188.7 μl를 첨가함으로써 네거티브 컨트롤을 생성한다. 양성 대조군의 경우, 반응 버퍼의 189.2 μL, AC-DEVD-AMC 10 mm의 0.8 μL 및 용해 버퍼의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 샘플을 품어37 O ℃에서 3 시간 동안 어둠 속에서 컨트롤 </li><li> 각 샘플 및 제어에 600 μL 글리신 0.4 M NaOH를 0.4 M (PH 10)과의 반응을 중지합니다. </li><li> 465 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장에 의해 형광 spectrofluorometry 정량화. 유리 큐벳의 반응에 증류수 2 ㎖를 추가합니다. 각 초에 1 포인트 10 초 동안 제어 및 샘플을 참조하십시오. </li><li> 각 샘플의 특정 활동을 정량화 : ((음 샘플 마이너스 긍정적 인 샘플의 형광) 2.8 ml를 X 볼륨의 형광) (단백질 25 mg을 배양 3 시간의 X 양의 시간)으로 나눈 값입니다. </li></ol>

<ol>
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저자가 공개하는 게 없다.

지난 10 년 동안이 프로토콜을 사용하여 우리의 경험은 중요한 방법 론적 문제의 식별되었다. 첫째, 짓 눌린 된 얼음에 페트리 접시에 빠른 뇌 해부 준비 품질을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 조직은 초음파 등의 심장 (10 초)과 같은 조직의 유형, 또는 신장 (20 초)에 비해 뇌에 대한 편도체 짧다고 실현되어야한다. 셋째, 큰 관심을 신중 샘플에 추가하기 전에, 기판을 혼합주의해야한다. 혼합 순서가 불충분 한 때 우리는 변수 신호가 발생했습니다. 샘플을 판독 할 때 제, 기포는 석영 셀에 존재할 수 없어야한다. 그렇지 않으면, 신호가 변경 될 수있다. 1 μL 미만의 체적을 피하기 위해 기판 ​​부피가 증가 : 우리는 결과의 재현성을 높이기 위해 지난 몇 년 동안 변화했다. 여전히 작은 변화는 연속 분석법 사이에서 발생할 수 있고, 적어도 3 개의 시료를 제어하는​​ 데 사용되어야변화를 제어 할 수 있습니다. 이러한 컨트롤 형광 측정 평균화하고, 평균 100 %로 설정된다. 실험 샘플의 형광 측정은 대조 시료의 퍼센트로 변환된다. 기술의 또 다른 한계는 따라서, 카스파 제 -3 활성을 과소 평가 될 수있는 조직의 일부만이 사용되도록하고. 실제로, 아폽토시스의 시간 윈도우는 임의의 주어진 셀 짧게 중이며 1,4,15 샘플링시의 인접 지역에서 발생하더라도 누락 될 수있다. 반대의 경우도 가능하다 : 세포 사멸은 카스파 제 -3 활동의 과대 평가 결과, 조직의 부분에서 특히 강렬한 될 수 있습니다. 우리는 TUNEL 분석 또는 Bax의 /에서 Bcl2 비율 (소개를 참조하십시오)와 같은 보완적인 기술에 대한 잔여 조직 (편도)의 사용을 권장합니다. Spectrofluorometry 웨스턴 블로 팅을 통해 적어도 두 가지 장점이 있습니다. 첫째, 직접 정량 데이터를 생성한다. 둘째, 효소를 측정ctivity 자체보다는 무관 할 수 있으며,이 단백질의 발현은 효소 활성의 변화없이 증가 할 수 있음을 공지 된 단백질 또는 RNA 발현. 또한, spectrofluorometry는 다른 조직 또는 다른 동물 종으로 수행 될 수 있고, 다른 기판에, 다른 카스파 아형에 대해 조절 될 수 있으므로, 그 비교는 안전 할 수있다. 결론적으로,이 문서는 세포 사멸 3 일 심근 경색 후 변연계의이 지역에서 발생하는 증거를 제공하는 편도체에서 카스파 제 -3 활성을 측정하는 spectrofluorometry을 사용하는 방법을 보여줍니다.

카스파 또는 시스테인 의존 아스 파르 테이트 지시 단백질 분해 효소는 다양한 항상성 processess 1에 관여하는 효소의 가족입니다. 카스파는 크게 아폽토시스 또는 염증의 역할에 따라 분류 될 수있다. 카스파-1, -4, -5 -12가 세포 사멸에 종사하는 사람들이있을 수있는 반면 염증에 관여하는 하위 분류 기자 카스파​​로 (카스파 제 8 -9)와 사형 집행 인의 카스파 (카스파 제 -3, -6 및 -7 ). 심근 경색 (MI) 또는 뇌허혈 후 관찰 카스파는 주로 세포 사멸이 과도 할 수있다 질환에 많은 병리에 중요한 역할을한다. 우리의 실험에 사용 된 후 MI 증후군의 쥐 모델에서, 카스파 제 -3은 심근 2뿐만 아니라 분위기 3-6과 감정의 제어에 연루되는 변연계에서뿐만 아니라 활성화되어 있음을 수립한다. 또한, 카스파 제 -3은 상이한 영역에서 활성화되는 것을 알 수있다변연계의 같은 편도체와 해마, 허혈성 모욕 4 후 3 일 주변이 활성화 피크로. 흥미롭게도, 카스파 제 -3 활성은 MI 후 행동 장애와 상관 관계 및 약리 및 영양 개입을 통해 감쇠는 카스파 제 -3 및 사후 MI 우울증 7-12 사이의 가능한 링크를 제안,이 부상을 줄일 수 있습니다. 카스파 제 -3 활성은 다양한 기법에 의해 측정 될 수있다. 웨스턴 블 롯팅은 카스파의 특성을 파악한 후 효소 활성 효소뿐만 아니라 프로 효소 형태를 검출 할 수있다. 웨스턴 블 롯팅은, 그러나, 반 정량적이고, 작은 변화는 약한 신호 - 대 - 잡음 비율 (13)을 통해 손실 될 수있다. 더 나은 기술이 형광 화합물을 해제하고 spectrofluorometry 의해 측정 될 수 카스파 제 (3)에 의한 기판 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 카스파 제 -3 활성화는 세포 사멸의 신뢰할 수있는 마커입니다. 세포 사멸의 CA의 측정N의 발생 시간 윈도우가 짧기 때문에 불안정하고, 인접 셀은 세포 자멸 소체 세포 또는 14 phagocytize 있었다. 아폽토시스는 또한 이러한 백스 / 같이 사멸 시그널링 캐스케이드 (6), 또는 항 - 세포 사멸 / 프로 단백질의 비율에 의한 DNA 단편화를 검출하는 그러한 터미널 데 옥시 뉴 클레오 타이 딜 트랜스퍼 dUTP 닉 엔드 (nick end) 표지화 (TUNEL) 분석과 같은 다른 기술들에 의해 확인 될 수있다 BCL2 6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Spectroflurometer</td>
			<td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td>
			<td>Ratiomaster M-40</td>
			<td>with DeltaRAM&#160; Random Access Monochromator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Respirator</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>683</td>
			<td>small animal ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cuvette</td>
			<td>NSG precision cells</td>
			<td>3G10</td>
			<td>Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>4710&#160; series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 50 Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

caspase-3 activity in the rat amygdala measured by spectrofluorometry after myocardial infarction

심근 경색 (MI)는 생리적 및 행동 수준에서 극적인 중장기 결과를 초래하지만, 관련된 메카니즘은 여전히​​ 불명확하다. 우리 연구소는 장애 심장 기능, 변연계의 신경 세포 손실,인지 결핍과 우울증의 행동 징후를 표시 MI 후 증후군의 쥐 모델을 개발했다. MI 후 삼일에 뾰족 - 신경 세포 수준에서 카스파 제 -3 활성화는 편도와 같은 다른 변연 지역에서 포스트 MI의 세포 사멸을 매개. 인지 및 행동 장애는 2-3주에게 포스트 MI를 표시하고 이러한 카스파 제 -3 활성의 조치를 통계적으로 상관 관계. 여기에 설명 된 프로토콜은 MI를 유도 편도 조직을 수집하고 spectrofluorometry를 사용 카스파 제 -3 활성을 측정하기 위해 사용된다. MI를 유도하기 위해, 하행 관상 동맥을 40 분간 폐색된다. 래트를 희생하고 편도선은 RAPI 격리 : 카스파 제 -3 활성의 평가를위한 프로토콜 3 일 후에 시작 MI뇌에서 DLY. 샘플은 신속하게 액체 질소에 냉동과 실제 분석 할 때까지 -80 ℃에서 보관됩니다. 카스파 제 -3 활성을 평가하기 위해 수행 spectrofluorometry 기법에 의해 측정 될 수있는 형광 화합물을 방출하여 카스파 제 -3 기질 (DEVD-AMC)의 절단에 기초한다. 방법론은 정량적 재현성하지만 필수 장비는 고가이고 샘플을 정량화하기위한 절차는 시간을 소모한다. 이 기술은 심장, 신장 같은 다른 조직에 적용될 수있다. DEVD-AMC 다른 카스파 제의 활성을 측정하기 위하여 다른 기판으로 대체 될 수있다.

편도 8 가짜 (제어) 및 삼일 허혈 / 재관류 프로토콜의 유도 후 8 MI 쥐에서 분리 하였다. 카스파 제 -3 활성은 활성 카스파 제 -3에 의해 절단하고 spectrofluorometry 의해 검출 될 수있는 형광 색소를 사용하여이 조직을 측정 하였다. 긍정과 부정 측정 (단계 3.11, 3.12 및 3.16 참조) 각 초에서 1 점으로, 10 초 동안 세중 수행하고 측정 하였다. 양성 및 음성 대조군의 차이를 산출하고,이 실험을 수행하는 동안 모든 조직에 대한 모의 차이의 평균을 100 %로 설정 하였다. MI 쥐의 결과는이 기준에 따라 조정하고, 그림 1은 최종 결과를 보여 그것은 가짜 (P &lt;0.05)에 비해 심근 경색 쥐에서 상당히 높은 활성을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> 도 1 카스파 제 -3MI 쥐의 편도체의 활동은, 100 % (그룹 당 8 쥐)로 설정, 가짜 컨트롤의 평균 활동의 백분율로 표시. * 상당한 집단 간 차이 (P &lt;0.05)를 나타냅니다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표현된다.

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Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K 조회수.  Hospital du Sacre-Coeur de Montreal. Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.

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Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable clinical state; in the development of animal models of focal ischemia, however, achieving reproducibility of experimentally induced infarct volume is essential. The rat is a widely used animal model for stroke due to its relatively low animal husbandry costs and to the similarity of its cranial circulation to that of humans2,3. In humans, the middle cerebral artery (MCA) is most commonly affected in stroke syndromes and multiple methods of MCA occlusion (MCAO) have been described to mimic this clinical syndrome in animal models. Because recanalization commonly occurs following an acute stroke in the human, reperfusion after a period of occlusion has been included in many of these models. In this video, we demonstrate the transient endovascular suture MCAO model in the spontaneously hypertensive rat (SHR). A filament with a silicon tip coating is placed intraluminally at the MCA origin for 60 minutes, followed by reperfusion. Note that the optimal occlusion period may vary in other rat strains, such as Wistar or Sprague-Dawley. Several behavioral indicators of stroke in the rat are shown. Focal ischemia is confirmed using T2-weighted magnetic resonance images and by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 24 hours after MCAO.

Surgical induction of ischemic brain damage in the rat is a widely used model for stroke research. Here we demonstrate the induction of focal cerebral ischemia by occlusion of the middle cerebral artery. Visualization of the resulting infarct by histological staining and magnetic resonance imaging is also shown.

쥐 중간 대뇌 동맥의 폐색의 Endovascular 봉합사에 의해 초점 대뇌 국소 빈혈 모델

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

연구

신경과학

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

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Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a reduction in neuronal population and function. Damaged axons can release excitatory molecules including potassium or glutamate into the extracellular matrix, which in turn, can produce further insult and injury to the supporting glial cells including astrocytes and oligodendrocytes 8, 16. If the insult persists, cells will undergo programmed cell death (apoptosis), which is regulated and activated by a number of well-established signal transduction cascades 14. Apoptosis and tissue necrosis can occur after traumatic brain injury, cerebral ischemia, and seizures. A classical example of apoptotic regulation is the family of cysteine-dependent aspartate-directed proteases, or caspases. Activated proteases including caspases have also been implicated in cell death in response to chronic neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Multiple Sclerosis 4, 14, 3, 11, 7.
In this protocol we describe the use of the NucView 488 caspase-3 substrate to measure the rate of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte (OLG) cell cultures 15, 5, following exposure to different extracellular stresses such as high concentrations of potassium or glutamate. The conditionally-immortalized N19-OLG cell line (representing the O2A progenitor) was obtained from Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, and has been previously used to study molecular mechanisms of myelin gene expression and signal transduction leading to OLG differentiation (e.g.6, 10). We have found this cell line to be robust with respect to transfection with exogenous myelin basic protein (MBP) constructs fused to either RFP or GFP (red or green fluorescent protein) 13, 12. Here, the N19-OLG cell cultures were treated with either 80 mM potassium chloride or 100 mM sodium glutamate to mimic axonal leakage into the extracellular matrix to induce apoptosis 9. We used a bi-functional caspase-3 substrate containing a DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 recognition subunit and a DNA-binding dye 2. The substrate quickly enters the cytoplasm where it is cleaved by intracellular caspase-3. The dye, NucView 488 is released and enters the cell nucleus where it binds DNA and fluoresces green at 488 nm, signaling apoptosis. Use of the NucView 488 caspase-3 substrate allows for live-cell imaging in real-time 1, 10. In this video, we also describe the culturing and transfection of immortalized N19-OLG cells, as well as live-cell imaging techniques.

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell imaging of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte cell cultures using the NucView 488 caspase-3 substrate. This technique is applicable for programmed cell death assays in real-time in a variety of cell types and tissues.

모니터링 죽습 Caspase - 3 활동 및 칼륨 - 유도 막 탈분극 다음 라이브 세포 이미징 및 Cleaveable 형광 염색 기판을 사용하여 불후의 Oligodendroglial 세포의 Apoptosis

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective treatment for several movement disorders that have failed to respond to medication. Recent progress in the field of DBS surgery has begun to extend the application of this surgical technique to other conditions as diverse as morbid obesity, depression and obsessive compulsive disorder. Despite these expanding indications, little is known about the underlying physiological mechanisms that facilitate the beneficial effects of DBS surgery. One approach to this question is to perform gene expression analysis in neurons that receive the electrical stimulation. Previous studies have shown that neurogenesis in the rat dentate gyrus is elicited in DBS targeting of the anterior nucleus of the thalamus1. DBS surgery targeting the ATN is used widely for treatment refractory epilepsy. It is thus of much interest for us to explore the transcriptional changes induced by electrically stimulating the ATN. In this manuscript, we describe our methodologies for stereotactically-guided DBS surgery targeting the ATN in adult male Wistar rats. We also discuss the subsequent steps for tissue dissection, RNA isolation, cDNA preparation and quantitative RT-PCR for measuring gene expression changes. This method could be applied and modified for stimulating the basal ganglia and other regions of the brain commonly clinically targeted. The gene expression study described here assumes a candidate target gene approach for discovering molecular players that could be directing the mechanism for DBS.

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

전방 시상 핵의 깊은 뇌 자극 후 쥐 해마의 유전자 발현 변화 분석

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when compared to warm-blooded vertebrates. Because of this, in vitro experiments in turtles can be performed for extended periods of time to investigate the neural signals and control of their target actions. Using an isolated head preparation, we measured the kinematics of eye movements in turtles, and their modulation by electrical signals carried by cranial nerves. After the brain was removed from the skull, leaving the cranial nerves intact, the dissected head was placed in a gimbal to calibrate eye movements. Glass electrodes were attached to cranial nerves (oculomotor, trochlear, and abducens) and stimulated with currents to evoke eye movements. We monitored eye movements with an infrared video tracking system and quantified rotations of the eyes. Current pulses with a range of amplitudes, frequencies, and train durations were used to observe effects on responses. Because the preparation is separated from the brain, the efferent pathway going to muscle targets can be examined in isolation to investigate neural signaling in the absence of centrally processed sensory information.

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

This protocol describes how to use an in vitro isolated turtle head preparation to measure the kinematics of their eye movements. After removal of the brain from the cranium, cranial nerves can be stimulated with currents to quantify rotations of the eye and changes in pupil sizes.

눈 기구학 생체 외에서 거북이에 두개골 신경의 자극에 의해 측정

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also demonstrate that traumatic brain injuries cause changes to the gut microbiota. However, mechanisms underlying the bidirectional regulation of the brain-gut axis remain unknown. Currently, few models exist for studying the changes in gut microbiota after traumatic brain injury. Therefore, the presented study combines protocols for inducing traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device and analysis of caecum samples following injury for investigating alterations in the gut microbiome. Alterations of the gut microbiota composition after traumatic brain injury are determined using 16S-rDNA sequencing. This protocol provides an effective method for studying the relationships between enteric microorganisms and traumatic brain injury.

Presented here is a protocol to induce diffuse traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device followed by the collection of the caecum content for gut microbiome analysis.

쥐에서 외상성 뇌 손상 후 Caecum Microbiota에서 변경 을 조사

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Establishment of Acute Pontine Infarction in Rats by Electrical Stimulation

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided here is a protocol for successfully establishing a rat model of acute pontine infarction. Rats weighing about 250 g are used, and a probe with an insulated sheath is injected into the pons using a stereotaxic apparatus. A lesion is produced by the electrical stimulation with a single pulse. The Longa score, Berderson score, and beam balance test are used to assess neurological deficits. Additionally, the adhesive-removal somatosensory test is used to determine sensorimotor function, and the limb placement test is used to evaluate proprioception. MRI scans are then used to assess the infarction in vivo, and TTC staining is used to confirm the infarction in vitro. Here, a successful infarction is identified that is located in the anterolateral basis of the rostral pons. In conclusion, a new method is described to establish an acute pontine infarction rat model.

Presented here is a protocol for establishing acute pontine infarction in a rat model via electrical stimulation with a single pulse.

전기 자극에 의한 쥐에 급성 폰틴 경색 의 설립

Pontine infarction is the most common stroke subtype in the posterior circulation, while there lacks a rodent model mimicking pontine infarction. Provided ...

심근 경색 후 Spectrofluorometry에 의해 측정 된 쥐 편도체에서 카스파 제 3 활동

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