This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Ce protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) à l&#39;Université de Géorgie. 1. Préparatifs <ol><li> Pour la culture de l&#39;ovocyte, l&#39;achat ou fraîchement préparer milieu essentiel minimal (MEM) et compléter avec 3 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) comme indiqué dans le tableau 1. Placez une bouteille de polystyrène sur une balance de chargement (de tare à zéro). Ajouter tous les réactifs, sauf BSA, dans l&#39;ordre et faire apparaître le volume final avec MQ-eau en poids pour un total de 250 g. Puis ajouter le BSA, laisser dissoudre et stériliser par filtration. Remarque: Le milieu MEM décrit nécessite l&#39;équilibrage et l&#39;incubation de la cellule avec un mélange de gaz à usage médical de 5% de CO 2, 5% d&#39;O 2 et 90% N 2. Cependant, d&#39;autres milieux (par exemple, CZB) peuvent être utilisés qui permettent une incubation des cellules dans 5% de CO 2 dans des conditions atmosphériques. </li><li> Pour ovocyte microinjection, acheter ou préparer le milieu M2. </li><li> Préparer pla gonadotrophine de sérum de jument régnante (PMSG) à une concentration de 5 UI / 100 ul. </li><li> Achat et reconstituer les stocks de siRNA à une concentration de travail de 1 uM. </li></ol> 2. Souris ovocytes Collection <ol><li> JOUR 1: Pour stimuler le développement du follicule ovarien et d&#39;augmenter le nombre de follicules pré-ovulatoire, administrer 5 UI de PMSG voie intrapéritonéale à des souris femelles 48 heures avant la collecte des ovocytes. </li><li> JOUR 3: Pour la collecte d&#39;ovocytes et culture, mis en place des boîtes de culture de 35 mm avec 3 ml de MEM / BSA additionné de 1 pg / ml milrinone. Cet inhibiteur de la phosphodiestérase maintient les ovocytes en prophase-je arrestation et prévient la dégradation de la vésicule germinale (GVBD). Equilibrer les boîtes de culture dans un mélange de gaz médicale pendant au moins 15 min. Note: Milrinone médias complété est nécessaire tout au long de la collecte des ovocytes, ainsi que la micro-injection d&#39;ovocytes et de la culture 24 heures cale période post siRNA. </li><li> Récupérer les ovaires de souris femelles utilisant laboratoire établi des pratiques 15 et transférer à une nouvelle boîte de culture avec préchauffé et équilibrée MEM / BSA / milrinone. </li><li> Placez la boîte de culture sur la scène d&#39;un stéréomicroscope pour la collecte d&#39;ovocytes. Sortie cumulus-ovocytes complexes (COC) en perforant manuellement les follicules antraux avec 27 g d&#39;aiguilles. Fixer un ovaire au fond de la boîte de culture, avec une aiguille 27 G fixée à une seringue de 1 ml, et en utilisant une seconde aiguille pour perforer tous les grands follicules. Répétez l&#39;opération pour chaque ovaire. </li><li> En utilisant des procédures bouche de pipetage standard ou d&#39;autres moyens de l&#39;aspiration des ovocytes, de collecter toutes les ovocytes qui sont entourés par 2 ou plusieurs couches de cellules du cumulus compacts. Transférer le COC à un nouveau plat et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Retirez délicatement les cellules du cumulus environnants par un léger pipetage répété avec une pipette de 1 ml réglé sur un volume d&#39;aspiration de 750 pi. Répétez l&#39;étape de pipetage environ 12 foiset permettent de récupérer les ovocytes pendant 5 min. Continuer de cette manière jusqu&#39;à ce que la totalité ou la plupart des cellules cumulus ont été supprimés. Transférer les ovocytes dénudés à une autre boîte de culture et de permettre à l&#39;équilibre à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Allouer les ovocytes dénudés en trois groupes expérimentaux à être utilisés pour: (i) la micro-injection de siRNA spécifiques contre la cible d&#39;intérêt, (ii) la micro-injection de non spécifiques (contrôle) siRNA, et (iii) un groupe de contrôle non-injecté pour tenir compte de des conditions de culture. </li></ol> 3. ovocytes microinjection <ol><li> Mettre en place des boîtes de culture de 3 ml de milieu M2 additionné de milrinone (1 ug / ml) pendant ovocytes micro-injection. Préparer des plats de culture contenant MEM / BSA / milrinone pour le lavage et la culture subséquente de ovocytes injectés. Remarque: le milieu M2 contient tampon Hepes et nécessite le préchauffage à 37 ° C pendant 15 min dans des conditions atmosphériques. MEM exige pré-réchauffement et l&#39;équilibre en utilisant des gaz médicaux comme décritD ci-dessus. </li><li> Préparer le système de micro-injection. Charger l&#39;aiguille d&#39;injection de 5 ul d&#39;une solution de siRNA spécifique de 1 uM. Fixez la pipette de maintien et aiguille d&#39;injection micromanipulateurs du système de micro-injection et mettre en place l&#39;unité d&#39;injection avec le volume et la pression calibrée. </li><li> Placez un 200 pi micro-goutte de M2 ​​médias sur l&#39;intérieur du couvercle d&#39;une boîte de culture de 3 cm et d&#39;ajouter un ovocyte pour mettre en place et l&#39;alignement du système de micro-injection. </li><li> Utilisation de l&#39;ovocyte comme un guide, ajuster les positions de l&#39;exploitation et injection aiguilles. Appliquer une pression négative à la pipette de maintien pour fixer doucement l&#39;ovocyte et ajuster la position de l&#39;aiguille d&#39;injection pour le diamètre le plus large de la cellule. Modification des réglages pour permettre à la micro-injection de 10 pl environ de la solution de siRNA n&#39;importe où dans le cytoplasme de l&#39;ovocyte. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figure 1. ovocytes microinjection mis en place. ( <strong&gt; A) Représentant l&#39;image d&#39;un 200 pi micro-goutte de M2 médias placé sur le couvercle d&#39;une boîte de culture de 3 cm, avec l&#39;aiguille de pipette de maintien et d&#39;injection positionné sur la gauche et la droite, respectivement. (B) Groupe de la prophase-je arrêté ovocytes (GV-scène) avant microinjection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </li><li> Retourner le couvercle à l&#39;étape de la loupe binoculaire et ajouter un pl 200 micro-goutte de support M2 frais. Ajouter un groupe d&#39;ovocytes (~ 10) pour la micro-goutte par voie orale pipetage, ou d&#39;autres méthodes, puis retourner le couvercle à micro-goutte à la phase de la micro-injection. <ol><li> Passez à la micro-injection des ovocytes individuels. Fixer un ovocyte avec la pipette de maintien, insérez-la délicatement la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection dans le cytoplasme et expulser le volume d&#39;injection de solution siRNA. Rétracter délicatement l&#39;aiguille d&#39;injection et move de l&#39;ovocyte injecté à une position au fond de la micro-goutte. Déplacez ovocytes injectés en vain à une position au sommet de la micro-goutte. </li><li> Répétez la procédure de micro-injection avec chaque ovocyte. Pour maintenir la viabilité des ovocytes optimale, micro-injection seulement un petit nombre d&#39;ovocytes à la fois. Assurez-vous que ce processus ne prend pas plus de quelques minutes pour éviter température et de pH des changements dans la micro-goutte. </li></ol></li><li> Aspirer injecté avec succès ovocytes ou déplacer le couvercle avec précaution avec le micro-goutte de ovocytes injectés à la loupe binoculaire. Transférer les ovocytes viables injectés par pipetage à la bouche ou des méthodes alternatives, à MEM / BSA moyen / milrinone à laver et équilibrer à 37 ° C. </li><li> Utilisation d&#39;un autre groupe d&#39;ovocytes, répétez le processus de micro-injection avec une nouvelle aiguille d&#39;injection chargé avec des ARNsi non spécifiques pour le groupe de contrôle. Laver les ovocytes dans MEM / BSA / milrinone et transfert à une boîte de culture distincte. </li><li> Culture tous les groupes deovocytes pendant 24 heures dans du MEM / BSA / milrinone à 37 ° C sous une atmosphère de gaz médical. Remarque: La période de culture «bloc de milrinone &#39;est nécessaire pour cible efficace ARNm / protéine épuisement. </li></ol> 4. Culture pour la maturation des ovocytes Meiotic <ol><li> JOUR 4: Pour chaque groupe expérimental d&#39;ovocytes mis en place 4 boîtes de culture (35 mm) avec 3 ml de MEM / BSA. Compléter un plat de médias par groupe avec 10% (de haute qualité) de sérum fœtal bovin (FBS) à utiliser pour la maturation des ovocytes. Permettre à tous les plats de culture pour équilibrer à 37 ° C avec un mélange de gaz médicaux. </li><li> Pour libérer des ovocytes à partir de &#39;bloc de milrinone&#39;, successivement laver les ovocytes à trois reprises dans les plats contenant MEM / BSA et ensuite transférer les ovocytes à l&#39;antenne de la maturation des milieux contenant 10% de FBS. Culture tous les groupes d&#39;ovocytes pendant 17 heures à 37 ° C, afin de permettre la reprise et la progression de la méiose. </li><li> Jour 5: Préparer des solutions pour ovocyte fixation, y compris: (i) 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du tampon PEM (100 mM de PIPES [pH 6,9], 1 mM de MgCl2, 1 mM d&#39;EGTA) avec 0,5% de Triton-X 100, et (ii) du PBS additionné de 5 FBS% qui seront utilisés à laver et à bloquer les ovocytes. Note: Ces solutions nécessitent préchauffage à 37 ° C avant l&#39;ovocyte fixation. </li><li> Pour la fixation de l&#39;ovocyte (après la culture de 17 h), rapidement transférer chaque groupe expérimental d&#39;ovocytes par pipetage à la bouche ou des méthodes alternatives dans des puits individuels (d&#39;un plat 4 puits) contenant 750 pi de pré-chauffé solution PFA 4% et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Par la suite laver chaque groupe d&#39;ovocytes 3 fois (15 minutes chacune) dans 750 ul de PBS préchauffé contenant 5% de FBS. </li><li> Ovocytes de bloc dans 200 pi de PBS / 5% de FBS O / N à 4 ° C pour minimiser les anticorps non spécifique contraignant. </li></ol> 5. Analyse d&#39;immunofluorescence <ol><li> JOUR 6: Note: immunocoloration est réalisée dans une plaque multi-puits et la OOCytes sont transférées en série dans les puits séquentielles, contenant des solutions d&#39;anticorps et de lavage respectifs. Soit 48 ou plaques à 96 puits peuvent être utilisés, il suffit de régler le volume de solution basée sur la taille bien. Pour les plaques à 96 puits en utilisant 200 pi par puits. Les ovocytes sont transférés vers les différentes solutions dans l&#39;ordre suivant: solution d&#39;anticorps primaire - 3 puits de lavage - solution d&#39;anticorps secondaire - 3 puits de lavage. Pour limiter l&#39;exposition de lumière la plaque peut être recouvert d&#39;une feuille. Préparer une solution fraîche PBS / 5% de FBS et utiliser cette solution pour préparer des dilutions d&#39;anticorps (par exemple, de lapin anti-pericentrin (1/1000), de souris anti-tubuline (1/1000)). </li><li> Transférer les ovocytes fixes de chaque groupe expérimental à chaque puits contenant 200 pi (100 pi ou, si l&#39;on souhaite moins de volume) de la solution d&#39;anticorps primaire et couvrir le puits avec du parafilm. Incuber selon les conditions spécifiques d&#39;anticorps optimales (par exemple, 37 ° C pendant 1 heure, ou 4 ° CO / N). Remarque: dilutio d&#39;anticorps primairen ainsi que le temps d&#39;incubation spécifique et la température exigent des tests pour déterminer les conditions optimales pour différents anticorps utilisés. </li><li> Après incubation avec l&#39;anticorps primaire, laver les ovocytes trois fois dans du PBS / 5% de FBS (10 à 15 min chacun). </li><li> Transférer les ovocytes dans la solution contenant des anticorps secondaires conjugués par fluorescence (par exemple, 1 / 1.000 dilution d&#39;anticorps anti-lapin et anti-souris conjugués avec des fluorochromes de longueurs d&#39;onde différentes). Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver les ovocytes trois fois dans du PBS / 5% de FBS (10 - 15 min chacun). </li><li> Après l&#39;étape de lavage final, transférer les ovocytes sur une lame de verre propre et doucement aspirer toute solution de lavage en excès. Cela immobiliser les ovocytes sur la surface du verre. Ajouter 8 pi de milieu (contenant DAPI) montage et superposer avec soin les supports de montage avec un 22 mm x 22 mm lamelle. Abaissez la lamelle lentement pour éviter les bulles d&#39;air et / ou d&#39;endommager les ovocytes. Remarque: vous pouvez, pour maintenir les propriétés 3-dimensionnelles de l&#39;ovocyte pour l&#39;analyse de la microscopie confocale, ajouter un petit volume de 100 perles de verre de um (mixtes avec de la gelée de pétrole) sur les coins de la lamelle avant de monter sur la diapositive. </li><li> Stocker les lames à 4 ° C, ou de procéder à l&#39;évaluation de la progression de la méiose, ainsi que l&#39;analyse des niveaux d&#39;expression et la localisation subcellulaire des protéines en utilisant un microscope à fluorescence équipé des filtres nécessaires pour correspondre aux anticorps secondaires utilisés. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Bien qu&#39;il existe plusieurs méthodes pour le transfert d&#39;acide nucléique exogène dans des cellules somatiques, telles que l&#39;électroporation et la transfection, micro-injection est le procédé optimal pour la livraison de molécules d&#39;ARN dans des ovocytes de souris transcriptionnellement quiescentes. Le protocole actuel fournit une approche efficace pour déplétion in vitro des ARNm spécifiques qui permettent des tests fonctionnels de la broche différente et / ou des facteurs de MTOC-ass...

La méiose est un processus de division unique qui se produit dans les gamètes (spermatozoïdes et les ovocytes) et comporte deux divisions successives sans intervenir la synthèse d&#39;ADN à séparer les chromosomes homologues et des chromatides sœurs cours de la méiose et de la méiose-I-II, respectivement 1. Erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la division de la méiose dans les ovocytes peuvent résulter de l&#39;aneuploïdie, qui est héritée par l&#39;embryon lors de la fécondation. Notamment, l&#39;incidence de l&#39;aneuploïdie dans les embryons en développement augmente avec l&#39;âge de la mère et est une cause majeure de malformations congénitales ainsi que la perte de la grossesse chez les femmes 1,2, donc, soulignant un besoin important de comprendre la base moléculaire de l&#39;aneuploïdie lors de la division de la méiose . Au cours de la division cellulaire, la ségrégation des chromosomes dépend essentiellement de l&#39;assemblage de l&#39;appareil de la broche de microtubules et l&#39;établissement d&#39;interactions chromosomiques-microtubules stables pour la fixation correcte de la broche opposéepôles. Surtout, la formation du fuseau méiotique dans des ovocytes de mammifères diffère de la mitose dans les cellules somatiques, et est régie par les centres de microtubules organisation uniques (MTOCs) qui manquent centrioles 3,4. Protéines essentielles nécessaires à la nucléation des microtubules et l&#39;organisation localisent à MTOCs d&#39;ovocytes, y compris γ-tubuline qui catalyse l&#39;assemblage des microtubules. En outre, pericentrin fonctionne comme une protéine d&#39;échafaudage essentiel, qui se lie et les ancrages y-tubuline, ainsi que d&#39;autres facteurs en MTOCs 5. En particulier, nos études montrent que l&#39;épuisement des protéines clés associés perturbe MTOC-organisation de fuseau méiotique et conduit à des erreurs de ségrégation des chromosomes dans les ovocytes qui ne sont pas complètement résolus par le point de contrôle de montage de broche (SAC) 6,7. Par conséquent, les défauts de stabilité broche, qui ne déclenchent pas arrêt de la méiose, représentent un risque important en contribuant à l&#39;aneuploïdie. Malgré leur rôle essentiel dans l&#39;assemblage de broche et de l&#39;organisation, prot ovocyte de MTOCcomposition et la fonction ein reste mal comprise. Test de la fonction des protéines cibles spécifiques dans des ovocytes de mammifères est difficile, car les cellules deviennent la transcription de repos peu avant la reprise de la méiose 8,9. Par conséquent, les ovocytes pré-ovulatoire comptent sur ​​les magasins d&#39;ARNm maternels de reprendre la méiose et soutiennent division méiotique ainsi que les premières divisions de clivage après la fécondation 10,11. L&#39;efficacité de l&#39;interférence ARN (ARNi) la dégradation médiée par des transcrits d&#39;ARNm dans les ovocytes de mammifères est bien établie et ARN maternels recrutés pour la traduction lors de la maturation méiotique se prêtent particulièrement bien à siRNA ciblant 12-14. Par conséquent, la micro-injection de courts ARN interférents (siRNA) dans des ovocytes fournit une approche valable pour épuiser ARNm cibles pour le test fonctionnel. Ici, nous décrivons les méthodes pour l&#39;isolement des ovocytes de souris et l&#39;épuisement des siRNA médiation de transcri spécifiquepts pour tester la fonction d&#39;une protéine associée MTOC essentielle, pericentrin. En outre, nous décrivons des conditions d&#39;analyse par immunofluorescence pour évaluer la formation du fuseau méiotique dans les ovocytes.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

La micro-injection de siRNA offre une approche efficace pour la dégradation de l&#39;ARNm et de protéine ultérieur épuisement dans des ovocytes, ce qui permet des tests fonctionnels efficace et hautement spécifique de différents facteurs cibles in vitro. Par la suite, l&#39;immunofluorescence est utilisée pour l&#39;analyse du phénotype spécifique, ainsi que pour valider protéine épuisement dans des ovocytes injectés de siARN. Dans l&#39;exemple actuel, le marquage fluorescent des ovocytes individue...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Ici, nous présentons un protocole de l&#39;épuisement de l&#39;ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d&#39;une analyse d&#39;immunofluorescence pour évaluer l&#39;assemblage du fuseau méiotique et de l&#39;organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l&#39;appauvrissement de produits de transcription in vitro et l&#39;évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vues.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes. ...

Vidéo: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transfert nucléaire dans des ovocytes de la souris

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Recherche

Biologie

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Récupération des ovocytes de souris

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

Taire à long terme de intersectine-1 dans les poumons de souris par livraison répétée d&#39;un siRNA spécifique via des liposomes cationiques. Évaluation des effets de sacrifiés par microscopie électronique

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...