This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso l&#39;Università della Georgia. 1. Preparativi <ol><li> Per la cultura ovocita, acquisto o appena preparare Minimal Essential Medium (MEM) e integrare con 3 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) come indicato nella tabella 1. Mettere una bottiglia di polistirene su una bilancia di carico (tara a zero). Aggiungi tutti i reagenti, ad eccezione di BSA, in ordine e portare il volume finale con MQ-acqua, in peso, per un totale di 250 g. Quindi aggiungere il BSA, permettere di sciogliere e filtro sterilizzare. Nota: Il mezzo MEM descritto richiede equilibrio e l&#39;incubazione delle cellule con una miscela di gas medicali 5% CO 2, 5% O 2 e 90% N 2. Tuttavia, altri mezzi (ad esempio, czb) possono essere utilizzate per consentire per l&#39;incubazione delle cellule in 5% CO 2 in condizioni atmosferiche. </li><li> Per ovocita microiniezione, acquistare o preparare M2 media. </li><li> Preparare psiero gonadotropina di cavalla regnante (PMSG) ad una concentrazione di 5 UI / 100 ml. </li><li> Acquisto e ricostituire le scorte siRNA ad una concentrazione di lavoro di 1 micron. </li></ol> 2. mouse ovociti Collection <ol><li> 1 ° GIORNO: per stimolare lo sviluppo del follicolo ovarico e aumentare il numero di follicoli pre-ovulatori, amministrare 5 UI di PMSG intraperitoneale a topi femmina 48 ore prima della raccolta degli ovociti. </li><li> GIORNO 3: Per la raccolta e la cultura degli ovociti, istituito 35 mm piatti della cultura con 3 ml di MEM / BSA integrato con 1 mg / ml milrinone. Questo inibitore della fosfodiesterasi mantiene gli ovociti in profase-in arresto e impedisce ripartizione vescicola germinale (GVBD). Equilibrare le piastre di coltura in una miscela di gas medicali per almeno 15 min. Nota: Milrinone supporto integrato è richiesta per tutto raccolta degli ovociti, così come ovocita microiniezione e la 24 ore cultura attesa periodo post siRNA. </li><li> Recuperare le ovaie dei topi femmina con laboratorio istituito pratica il 15 e il trasferimento ad un nuovo piatto cultura con pre-riscaldato ed equilibrato MEM / BSA / milrinone. </li><li> Posizionare il piatto cultura sul palcoscenico di uno stereomicroscopio per la raccolta degli ovociti. Stampa cumulo-ovocita-complessi (COC di) da puntura manualmente i follicoli antrali con 27 aghi G. Fissare un ovaio al fondo del piatto di coltura, con un ago 27 G attaccato ad una siringa da 1 ml, e utilizzare un secondo ago per perforare tutti follicoli grandi. Ripetere per ogni ovaio. </li><li> Utilizzando le procedure di pipette a bocca standard o altri mezzi di aspirazione dell&#39;ovocita, raccogliere tutti gli ovociti che sono circondati da 2 o più strati di cellule del cumulo compatte. Trasferire il COC di un nuovo piatto e incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Rimuovere con attenzione le cellule del cumulo circostanti di ripetuto pipettaggio gentile con una pipetta 1 ml impostato su un volume di aspirazione di 750 ml. Ripetere il passaggio pipettamento circa 12 voltee permettono di recuperare gli ovociti per 5 min. Continuare in questo modo fino a quando tutti o la maggior parte delle cellule del cumulo sono stati rimossi. Trasferire gli ovociti denudati all&#39;altro piatto cultura e lasciar equilibrare a 37 ° C per 15 min. </li><li> Assegnare gli ovociti denudati in tre gruppi sperimentali da utilizzare per: (i) la microiniezione di siRNA specifici contro il bersaglio di interesse, (ii) la microiniezione di aspecifici (controllo) siRNA, e (iii) un gruppo non-iniezione di controllo per tenere conto di condizioni di coltura. </li></ol> 3. Microiniezione degli ovociti <ol><li> Istituito piatti della cultura con 3 ml di mezzi M2 integrato con milrinone (1 mg / ml) per ovocita microiniezione. Preparare piatti della cultura contenenti MEM / BSA / milrinone per il lavaggio e la successiva cultura di ovociti iniettati. Nota: M2 terreno contiene tampone HEPES e richiede pre-riscaldamento a 37 ° C per 15 minuti in condizioni atmosferiche. MEM richiede la pre-riscaldamento e equilibrio con gas medicali come descrittod sopra. </li><li> Preparare il sistema di microiniezione. Caricare l&#39;ago di iniezione con 5 ml di soluzione di specifici siRNA 1 micron. Fissare la pipetta detenzione e ago per iniezione per micromanipolatori del sistema microiniezione e impostare l&#39;unità di iniezione con il volume e la pressione calibrata. </li><li> Inserire un 200 microlitri micro-goccia di M2 supporti sulla parte interna del coperchio di un piatto di coltura 3 cm e aggiungi ovocita per impostare e allineamento del sistema microiniezione. </li><li> Utilizzando l&#39;ovocita come guida, regolare le posizioni degli aghi holding e iniezione. Applicare pressione negativa alla pipetta tenuta per fissare delicatamente l&#39;oocita e regolare la posizione dell&#39;ago di iniezione al più ampio diametro della cellula. Regolare le impostazioni per consentire microiniezione di circa 10 pl della soluzione siRNA ovunque nel citoplasma dell&#39;ovocita. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. ovociti microiniezione istituito. ( <strong&gt; A) di una immagine rappresentativa 200 microlitri micro-goccia di M2 multimediale presente sul coperchio di un piatto di coltura 3 cm, con la pipetta tenuta e iniezione ago posizionato sul rispettivamente a sinistra ea destra,. (B) Gruppo di profase-I arrestato ovociti (GV-stadio) prima microiniezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </li><li> Riportare il coperchio alla fase stereomicroscopio e aggiungere 200 microlitri di micro-goccia di supporto M2 fresco. Aggiungere un gruppo di ovociti (~ 10) per il micro-goccia a pipette a bocca, o metodi alternativi, per poi tornare il coperchio con micro-drop per la fase di microiniezione. <ol><li> Procedere alla microinject singoli ovociti. Fissare un ovocita con la pipetta detenzione, inserire lentamente la punta di un ago per l&#39;iniezione nel citoplasma ed espellere il volume di iniezione di soluzione di siRNA. Ritrarre con attenzione l&#39;ago di iniezione e move l&#39;ovocita iniettato in una posizione nella parte inferiore del micro-drop. Spostare ovociti iniettati senza successo ad una posizione in alto della micro-drop. </li><li> Ripetere la procedura di microiniezione con ogni ovocita. Per mantenere la vitalità degli ovociti ottimale, microinject solo un piccolo numero di ovociti per volta. Assicurarsi che questo processo non richiede più di qualche minuto per evitare temperatura e pH cambiamenti nella micro-drop. </li></ol></li><li> Aspirare iniettato con successo ovociti o spostare con cautela il coperchio con il micro-goccia di ovociti iniettati al stereomicroscopio. Trasferire gli ovociti vitali iniettati per via orale pipettando o metodi alternativi, a MEM / BSA medio / milrinone per lavare ed equilibrare a 37 ° C. </li><li> Utilizzando un altro gruppo di ovociti, ripetere il processo microiniezione con un nuovo ago per iniezione caricato con siRNA non specifici per il gruppo di controllo. Lavare gli ovociti in MEM / BSA / milrinone e trasferimento in un piatto di coltura separata. </li><li> Cultura tutti i gruppi dioociti per 24 ore in MEM / BSA / milrinone a 37 ° C in atmosfera di gas medicale. Nota: Il &#39;blocco milrinone&#39; periodo di coltura è necessario per obiettivo efficiente mRNA / proteine ​​esaurimento. </li></ol> 4. ovociti cultura per la maturazione meiotica <ol><li> 4 ° GIORNO: Per ogni gruppo sperimentale di ovociti set-up 4 capsule di Petri (35 mm) con 3 ml di MEM / BSA. Supplemento un piatto dei media per ogni gruppo con il 10% (di alta qualità) siero fetale bovino (FBS) da utilizzare per la maturazione degli ovociti. Consentire a tutti i piatti della cultura equilibrare a 37 ° C con miscela di gas medicali. </li><li> Per rilasciare ovociti da &#39;blocco milrinone&#39;, sequenza lavare gli ovociti tre volte in piatti contenenti MEM / BSA e poi trasferire gli ovociti al piatto contenente la maturazione media con il 10% FBS. Cultura tutti i gruppi di ovociti per 17 ore a 37 ° C, per consentire la ripresa e la progressione della meiosi. </li><li> GIORNO 5: Preparare soluzioni per ovocita fixazione, tra cui: (i) 4% paraformaldeide (PFA) in tampone PEM (TUBI 100 mM [pH 6,9], 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA) con 0,5% Triton-X 100, e (ii) PBS integrato con 5 % FBS che verranno utilizzati per il lavaggio e bloccare gli ovociti. Nota: Queste soluzioni richiedono pre-riscaldamento a 37 ° C prima della fissazione degli ovociti. </li><li> Per ovocita fissaggio (dopo la cultura 17 ore), velocemente trasferire ogni gruppo sperimentale di ovociti da pipette a bocca o metodi alternativi in ​​singoli pozzi (di un piatto 4-bene) contenente 750 ml di pre-riscaldato soluzione al 4% PFA e incubare a 37 ° C per 1 ora. Successivamente lavare ogni gruppo di ovociti 3 volte (15 min ciascuna) in 750 ml di PBS preriscaldata contenenti il ​​5% FBS. </li><li> Ovociti Block in 200 l di PBS / 5% FBS O / N a 4 ° C per ridurre al minimo l&#39;anticorpo aspecifico vincolante. </li></ol> Analisi 5. immunofluorescenza <ol><li> GIORNO 6: Nota: immunocolorazione è fatto in una piastra multi-pozzo e la OOCytes sono in serie trasferiti a pozzi sequenziali, contenente rispettive soluzioni di anticorpi e di lavaggio. O 48 o 96 pozzetti piastre possono essere utilizzate, è sufficiente regolare il volume della soluzione in base alle dimensioni ben. Per piastre a 96 pozzetti utilizzare 200 ml per pozzetto. Gli oociti vengono trasferiti alle diverse soluzioni nel seguente ordine: soluzione di anticorpo primario - 3 pozzi di lavaggio - soluzione di anticorpo secondario - 3 pozzi di lavaggio. Al fine di limitare l&#39;esposizione alla luce la lastra può essere coperto con un foglio. Preparare fresco PBS / 5% FBS e utilizzare questa soluzione per preparare diluizioni di anticorpi (ad esempio, di coniglio anti-pericentrin (1 / 1.000), topo anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> Trasferire gli ovociti fissi di ogni gruppo sperimentale a singoli pozzetti contenenti 200 microlitri (o 100 microlitri, se si desidera un volume inferiore) della soluzione di anticorpo primario e coprire il pozzo con parafilm. Incubare secondo condizioni specifiche anticorpali ottimali (ad esempio, 37 ° C per 1 ora, o 4 ° CO / N). Nota: dilutio anticorpo primarion così come il tempo e la temperatura di incubazione specifico richiedono test per determinare le condizioni ottimali per differenti anticorpi utilizzati. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con l&#39;anticorpo primario, lavare gli ovociti tre volte in PBS / 5% FBS (10-15 min ciascuna). </li><li> Trasferire gli ovociti nella soluzione contenente anticorpi secondari coniugati fluorescenza (ad esempio, 1 / 1.000 diluizione di anticorpi anti-coniglio e anti-topo coniugato con fluorocromi di diverse lunghezze d&#39;onda). Incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Lavare gli ovociti tre volte in PBS / 5% FBS (10 - 15 minuti ciascuna). </li><li> Dopo la fase di lavaggio finale, di trasferire gli ovociti su un vetrino pulito e delicatamente aspirare qualsiasi soluzione di lavaggio in eccesso. Ciò immobilizzare gli ovociti sulla superficie del vetro. Aggiungere 8 ml di mezzi (contenente DAPI) montaggio e sovrapposizione con attenzione il supporto di montaggio con un x 22 mm polizza di copertura di 22 mm. Abbassare il vetrino lentamente per evitare di intrappolare bolle d&#39;aria e / o danneggiare gli ovociti. Nota: In alternativa, per mantenere le proprietà 3-dimensionali del ovocita per analisi microscopia confocale, aggiungere un piccolo volume di perline di vetro 100 micron (misti con vaselina) agli angoli del vetrino prima del montaggio sul vetrino. </li><li> Conservare i vetrini a 4 ° C, o procedere alla valutazione della progressione meiotica e l&#39;analisi dei livelli di espressione e la localizzazione subcellulare di proteine ​​usando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri necessari a anticorpi secondari utilizzati. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Mentre ci sono diversi metodi per esogena trasferimento di acidi nucleici nelle cellule somatiche, come elettroporazione e transfezione, microiniezione è il metodo ottimale per la consegna di molecole di RNA in ovociti trascrizionalmente quiescenti del mouse. Il protocollo attuale prevede un approccio efficace per esaurimento in vitro di specifici mRNA che consentono il collaudo funzionale di diverso fuso e / o fattori MTOC associate in ovociti. Questo approccio si traduce in efficienza esaurimento trascrizion...

La meiosi è un processo di divisione unica che si verifica in gameti (ovociti e spermatozoi) e coinvolge due divisioni successive senza intervenire sintesi del DNA per separare i cromosomi omologhi e cromatidi fratelli durante la meiosi I e meiosi II, rispettivamente, 1. Errori nella segregazione dei cromosomi durante la divisione meiotica in oociti possono causare aneuploidia, che viene ereditato dalla embrione durante la fecondazione. In particolare, l&#39;incidenza di aneuploidie negli embrioni in via di sviluppo aumenta con l&#39;avanzare dell&#39;età materna, ed è una delle principali cause di difetti di nascita congeniti così come la perdita di gravidanza nelle donne 1,2, quindi, sottolineando l&#39;importante necessità di comprendere le basi molecolari di aneuploidie durante la divisione meiotica . Durante la divisione cellulare, la segregazione dei cromosomi è strettamente dipendente dalla assemblea degli apparati microtubuli fuso e la creazione di interazioni stabili cromosomiche-microtubuli per un corretto attaccamento al mandrino oppostopali. È importante sottolineare che la formazione del fuso meiotico in ovociti di mammiferi si differenzia da mitosi nelle cellule somatiche, ed è regolata da centri-microtubuli organizzare unici (MTOC) che mancano centrioli 3,4. Proteine ​​essenziali necessari per microtubuli nucleazione e di organizzazione localizzano a MTOC ovociti, tra cui γ-tubulina che catalizza dei microtubuli. Inoltre, pericentrin funziona come una proteina essenziale impalcature, che lega e ancoraggi gamma-tubulina, nonché altri fattori in MTOC 5. In particolare, i nostri studi dimostrano che la deplezione delle proteine ​​MTOC associate chiave interrompe organizzazione fuso meiotico e porta ad errori cromosoma segregazione in ovociti, che non sono completamente risolti con il checkpoint del fuso (SAC) 6,7. Pertanto, difetti di stabilità mandrino, che non attivano l&#39;arresto meiotica, presentano un rischio significativo nel contribuire a aneuploidie. Nonostante il loro ruolo essenziale per il montaggio del mandrino e organizzazione, prot ovociti MTOCcomposizione e la funzione ein rimane poco compresa. Testare la funzione di specifiche proteine ​​bersaglio negli ovociti di mammiferi è impegnativo, in quanto le cellule diventano trascrizionalmente quiescenza poco prima della ripresa della meiosi 8,9. Quindi, ovociti pre-ovulatori si affidano a negozi mRNA materni per riprendere la meiosi e sostenere divisione meiotica così come le prime divisioni scissione dopo la fecondazione 10,11. L&#39;efficacia di RNA interference (RNAi) la degradazione mediata di trascritti di mRNA negli ovociti di mammiferi è ben consolidata e RNA materni reclutati per la traduzione durante la maturazione meiotica sono particolarmente suscettibili di siRNA targeting per 12-14. Pertanto, la microiniezione di brevi RNA interferenti (siRNA) in ovociti offre un valido approccio per esaurire mRNA bersaglio per i test funzionali. Qui, descriviamo i metodi per l&#39;isolamento di ovociti di topo e di siRNA mediata esaurimento delle transcri specificopts per testare la funzione di una proteina essenziale MTOC-associata, pericentrin. Inoltre, si descrivono le condizioni di analisi di immunofluorescenza per valutare la formazione del fuso meiotico in ovociti.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare&#039;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recipe outlined in Table 1</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G, potassium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Essential Amino Acids (50x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs targeting Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Micro-injections System</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulators</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injection needles (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Holding pipettes (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA Filter System</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Microiniezione di siRNAs fornisce un approccio efficace per la degradazione dell&#39;mRNA e successiva deplezione proteica in oociti, che consente efficiente e altamente specifico collaudo funzionale di diversi fattori bersaglio in vitro. Successivamente, immunofluorescenza viene utilizzato per l&#39;analisi specifica fenotipo e convalidare deplezione proteica in ovociti siRNA-iniettato. Nell&#39;esempio corrente, marcatura fluorescente di ovociti individuali con DAPI insieme con anticorpi anti-tubulina ed anti...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l&#39;organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

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Biology

11.6K Views.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l'organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti. 

Video: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Ricerca

Genetica

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

Valutazione della maturità dell'uovo umano e la sua applicazione clinica

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Biologia dello sviluppo

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at prophase I of the first meiotic division. After puberty and upon meiotic resumption, the nuclear membrane disassembles (nuclear envelope breakdown), and the spindle is assembled mainly at the oocyte center. Initial central spindle positioning is essential to protect against abnormal kinetochore-microtubule (MT) attachments and aneuploidy. The centrally positioned spindle migrates in a time-sensitive manner toward the cortex, and this is a necessary process to extrude a tiny polar body. In mitotic cells, spindle positioning relies on the interaction between centrosome-mediated astral MTs and the cell cortex. On the contrary, mouse oocytes lack classic centrosomes and, instead, contain numerous acentriolar MT organizing centers (MTOCs). At the metaphase I stage, mouse oocytes have two different sets of MTOCs: (1) MTOCs that are clustered and sorted to assemble spindle poles (polar MTOCs), and (2) metaphase cytoplasmic MTOCs (mcMTOCs) that remain in the cytoplasm and do not contribute directly to spindle formation but play a crucial role in regulating spindle positioning and timely spindle migration. Here, a multi-photon laser ablation method is described to selectively deplete endogenously labeled mcMTOCs in oocytes collected from Cep192-eGfp reporter mice. This method contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying spindle positioning and migration in mammalian oocytes.

An optimized protocol is presented that enables the depletion of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes during metaphase I using a near-infrared femtosecond laser.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Identificazione del danno al DNA negli ovociti arrestati con profase di topi

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autore in primo piano: Comprendere la risposta al danno al DNA negli ovociti dei mammiferi e negli embrioni preimpianto 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Usando i Oocytes del Mouse per valutare la funzione del Gene umano durante la meiosi I

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Valutazione della maturità dell'uovo umano e la sua applicazione clinica

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Rilevamento di rotture a doppio filamento di DNA in ovociti di topo

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione