This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Georgia. 1. Preparativos <ol><li> Para el cultivo de los ovocitos, compra o recién preparar Medio Esencial Mínimo (MEM) y complementar con 3 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) como se indica en la Tabla 1. Coloque una botella de poliestireno en un equilibrio de carga (tara a cero). Añadir todos los reactivos, excepto BSA, en orden y que aparezca el volumen final con MQ-agua en peso a un total de 250 g. A continuación, agregue la BSA, deje que se disuelva y esterilizar filtro. Nota: El medio MEM descrito requiere de equilibración y la incubación de células con una mezcla de gases médica de 5% de CO 2, 5% O 2 y 90% N 2. Sin embargo, otros medios de comunicación (por ejemplo, CZB) se pueden usar que permiten la incubación de las células en 5% de CO 2 en condiciones atmosféricas. </li><li> Para la microinyección de ovocitos, comprar o preparar medio M2. </li><li> Preparar pgonadotropina de suero de yegua reinante (PMSG) a una concentración de 5 UI / 100 l. </li><li> Compra y reconstituir las reservas siRNA a una concentración de trabajo de 1 mM. </li></ol> 2. ratón ovocitos Colección <ol><li> DÍA 1: Para estimular el desarrollo del folículo ovárico y aumentar el número de folículos pre-ovulatorios, administrar 5 UI de PMSG por vía intraperitoneal a ratones hembra de 48 horas antes de la recolección de los ovocitos. </li><li> DÍA 3: Para la recolección de los ovocitos y la cultura, estableció placas de cultivo de 35 mm con 3 ml de MEM / BSA suplementado con 1 mg / ml milrinona. Este inhibidor de la fosfodiesterasa mantiene los ovocitos en profase I arreste y evita la ruptura de la vesícula germinal (GVBD). Equilibrar las placas de cultivo en una mezcla de gases médica durante al menos 15 min. Se requiere Milrinona medio suplementado en toda la colección de ovocitos, así como la microinyección de ovocitos y el 24 horas de retención cultura período posterior siRNA: Nota. </li><li> Recuperar los ovarios de los ratones hembra utilizando laboratorio establecido prácticas 15 y traslado a una nueva placa de cultivo con pre-calentado y se equilibró MEM / BSA / milrinona. </li><li> Coloque la placa de cultivo en el escenario de un microscopio estereoscópico para la recolección de los ovocitos. Lanzamiento de cúmulo-ovocito complejos (COC de) perforando manualmente los folículos antrales con 27 G agujas. Fijar un ovario a la parte inferior de la placa de cultivo, con una aguja de 27 G unida a una jeringa de 1 ml, y utilizar una segunda aguja para perforar todos los folículos grandes. Repita el procedimiento para cada ovario. </li><li> Usando procedimientos boca pipeteo estándar u otros medios de aspiración de ovocitos, recoger todos los ovocitos que están rodeados por 2 o más capas de células del cumulus compactos. Transferir el COC de un nuevo plato y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Retire con cuidado las células del cumulus que rodean por repetido pipeteo suave con una pipeta 1 ml ajustado a un volumen de aspiración de 750 l. Repita el paso de pipeteo cerca de 12 vecesy permitir que los ovocitos se recuperen durante 5 min. Continúe de esta manera hasta que todos o la mayoría de las células del cúmulo se han eliminado. La transferencia de los ovocitos denudados a otra placa de cultivo y permitir que se equilibre a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Asignar los ovocitos denudados en tres grupos experimentales que se utilizarán para: (i) la microinyección de siRNAs específicos contra el blanco de interés, (ii) la microinyección de (control) siRNAs inespecíficos, y (iii) un grupo no inyectada de control para tener en cuenta condiciones de cultivo. </li></ol> 3. La microinyección de ovocitos <ol><li> Establecer placas de cultivo con 3 ml de medio M2 suplementado con milrinona (1 mg / ml) para la microinyección de ovocitos. Preparar placas de cultivo que contenían MEM / BSA / milrinona para el lavado y la posterior cultura de ovocitos inyectados. Nota: medio M2 contiene HEPES tampón y requiere pre-calentamiento a 37 ° C durante 15 minutos en condiciones atmosféricas. MEM requiere pre-calentamiento y el equilibrio usando gases medicinales como describird arriba. </li><li> Prepare el sistema de microinyección. Cargue la aguja de inyección con 5 l de solución de siRNA 1 M. Asegure la pipeta de sujeción y la aguja de inyección para micromanipuladores del sistema de microinyección y configurar la unidad de inyección con el volumen y la presión calibrada. </li><li> Coloque un 200 l micro-gota de medios M2 en el interior de la tapa de una placa de cultivo de 3 cm y añadir un ovocito para configurar y alineación del sistema de microinyección. </li><li> Utilizando el ovocito como guía, ajuste las posiciones de la explotación y de inyección de agujas. Aplicar presión negativa a la pipeta de sujeción para fijar suavemente el ovocito y ajustar la posición de la aguja de inyección con el diámetro más ancho de la célula. Ajustar la configuración para permitir que la microinyección de aproximadamente 10 pl de la solución de siRNA en cualquier lugar en el citoplasma del ovocito. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. ovocitos microinyección creó. ( <strong&gt; A) imagen representativa de una micro-200 l gota de medios de comunicación M2 colocado en la tapa de una placa de cultivo de 3 cm, con la aguja de sujeción de la pipeta y la inyección colocado a la izquierda y derecha, respectivamente. (B) Grupo de la profase I arrestado ovocitos (GV-etapa) antes de la microinyección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </li><li> Devuelva la tapa para la etapa de microscopio estereoscópico y añadir un 200 l micro-gota de medios M2 fresco. Añadir un grupo de ovocitos (~ 10) a la micro-gota mediante pipeteo boca, o métodos alternativos, a continuación, devolver la tapa con micro-gota a la etapa de microinyección. <ol><li> Proceda a microinyectar los ovocitos individuales. Asegurar un ovocito con la pipeta tenencia, introduzca lentamente la punta de la aguja de inyección en el citoplasma y expulsar el volumen de inyección de la solución de siRNA. Retraer con cuidado la aguja de inyección y move el oocito inyectado a una posición en la parte inferior de la micro-drop. Mueva ovocitos inyectados, sin éxito, a una posición en la parte superior de la micro-drop. </li><li> Repita el procedimiento de microinyección con cada ovocito. Para mantener la viabilidad de oocitos óptima, microinyectar sólo un pequeño número de ovocitos a la vez. Asegúrese de que este proceso no toma más de unos pocos minutos para evitar que la temperatura y pH cambios en la micro-drop. </li></ol></li><li> Aspirar inyecta éxito ovocitos o mover con cuidado la tapa con el micro-gota de ovocitos inyectados con el microscopio estereoscópico. La transferencia de los ovocitos viables inyectados con la pipeta boca o métodos alternativos, al MEM / BSA medio / milrinona de lavar y equilibrar a 37 ° C. </li><li> El uso de otro grupo de ovocitos, repita el proceso de microinyección con una nueva aguja de inyección cargado con siRNAs no específicos para el grupo de control. Lave los ovocitos en MEM / BSA / milrinona y traslado a una placa de cultivo separado. </li><li> Cultura todos los grupos deovocitos durante 24 horas en MEM / BSA / milrinona a 37 ° C en una atmósfera de gas médico. Nota: Se necesita el periodo de cultivo &#39;bloque milrinona&#39; para la meta eficiente agotamiento ARNm / proteína. </li></ol> 4. ovocitos de la cultura para la maduración meiótica <ol><li> DÍA 4: Para cada grupo experimental de ovocitos configuración 4 placas de cultivo (35 mm) con 3 ml de MEM / BSA. Suplemento un plato medios por grupo con 10% de suero bovino fetal (de alta calidad) (FBS) a utilizar para la maduración de ovocitos. Permitir que todos los platos de cultivo se equilibren a 37 ° C con la mezcla de gases medicinales. </li><li> Para liberar ovocitos de &quot;bloque milrinona &#39;, secuencialmente lavar los ovocitos tres veces en platos que contienen MEM / BSA y luego transferir los ovocitos al plato que contiene la maduración de medios con 10% de FBS. Cultura todos los grupos de ovocitos de 17 horas a 37 ° C, para permitir la reanudación y la progresión de la meiosis. </li><li> DÍA 5: Preparar soluciones para fixa ovocitoción, incluyendo: (i) 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón PEM (TUBOS 100 mM [pH 6,9], 1 mM de MgCl 2, 1 mM EGTA) con 0,5% de Triton-X 100, y (ii) PBS suplementado con 5 % de FBS que se utilizarán para lavar y bloquear los ovocitos. Nota: Estas soluciones requieren pre-calentamiento a 37 ° C antes de la fijación de los ovocitos. </li><li> Para la fijación de los ovocitos (después del cultivo 17 hr), con rapidez transferir cada grupo experimental de los oocitos mediante pipeteado boca o métodos alternativos en los pocillos individuales (de un plato de 4 pocillos) que contiene 750 l de pre-calentado solución PFA 4% y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. Posteriormente lavar cada grupo de ovocitos 3 veces (15 min cada uno) en 750 l de PBS precalentado que contienen 5% de FBS. </li><li> Ovocitos bloque en 200 l de PBS / 5% de FBS O / N a 4 ° C para minimizar la unión inespecífica del anticuerpo. </li></ol> Análisis 5. Inmunofluorescencia <ol><li> DÍA 6: Nota: La inmunotinción se realiza en una placa multi-pocillo y la OOCytes se transfieren en serie a los pocillos secuenciales, que contiene respectivas soluciones de anticuerpos y de lavado. Cualquiera de 48 o 96 pocillos placas se pueden usar, simplemente ajustar el volumen de la solución basada en el tamaño también. Para placas de 96 pocillos utilizar 200 l por pocillo. Los ovocitos se transfieren a las diferentes soluciones en el orden siguiente: solución de anticuerpo primario - 3 pozos de lavado - solución de anticuerpo secundario - 3 pozos de lavado. Para limitar exposición a la luz de la placa se puede cubrir con papel de aluminio. Preparar fresco PBS / 5% de FBS y utilizar esta solución para preparar diluciones de anticuerpos (por ejemplo, conejo anti-pericentrina (1 / 1.000), ratón anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> La transferencia de los ovocitos fijos de cada grupo experimental a los pocillos individuales que contienen 200 l (o 100 l, si se desea menos volumen) de la solución de anticuerpo primario y tapar el pozo con parafilm. Incubar acuerdo con las condiciones óptimas de anticuerpo específico (por ejemplo, 37 ° C durante 1 hr, o 4 ° CO / N). Nota: El anticuerpo primario dilution así como el tiempo de incubación y la temperatura específica requieren pruebas para determinar las condiciones óptimas para diferentes anticuerpos utilizados. </li><li> Después de la incubación con el anticuerpo primario, se lavan los ovocitos tres veces en PBS / FBS al 5% (10-15 min cada uno). </li><li> La transferencia de los ovocitos en la solución que contiene anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (por ejemplo, 1 / 1.000 de dilución de anticuerpos anti-conejo y anti-ratón conjugado con fluorocromos de diferentes longitudes de onda). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar los ovocitos tres veces en PBS / FBS al 5% (10 - 15 min cada uno). </li><li> Tras la etapa de lavado final, la transferencia de los ovocitos en un portaobjetos de vidrio limpio y suavemente aspirar cualquier exceso de solución de lavado. Esto inmovilizar los ovocitos en la superficie de vidrio. Añadir 8 l de los medios de comunicación (que contiene DAPI) montaje y superponer cuidadosamente los medios de montaje con un 22 mm x 22 mm cubreobjetos. Baje el cubreobjetos lentamente para evitar atrapar burbujas de aire y / o dañar los ovocitos. Nota: Como alternativa, para mantener las propiedades 3-dimensionales de los ovocitos para el análisis de microscopía confocal, añadir un pequeño volumen de 100 cuentas de vidrio micras (mezclado con vaselina) a las esquinas de la hoja de la cubierta antes de montar en la diapositiva. </li><li> Diapositivas se almacenan a 4 ° C, o proceder a la evaluación de la progresión meiótica, así como el análisis de los niveles de expresión y localización subcelular de proteínas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros necesarios para que coincida con los anticuerpos secundarios utilizados. </li></ol>

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Si bien hay varios métodos para la transferencia de ácido nucleico exógeno en las células somáticas, tales como la electroporación y la transfección, microinyección es el método óptimo para la entrega de moléculas de RNA en oocitos de ratón transcripcionalmente quiescentes. El protocolo actual ofrece un enfoque eficaz para el agotamiento in vitro de ARNm específicos que permiten a las pruebas funcionales de diferente huso y / o factores MTOC asociada en ovocitos. Este enfoque se traduce en el agota...

La meiosis es un proceso de división único que ocurre en gametos (ovocitos y espermatozoides) y consiste en dos divisiones sucesivas sin intervenir la síntesis de ADN para segregar los cromosomas homólogos y cromátidas hermanas durante la meiosis I y meiosis II, respectivamente 1. Los errores en la segregación cromosómica durante la división meiótica en ovocitos pueden dar lugar a aneuploidía, que se hereda por el embrión durante la fertilización. En particular, la incidencia de la aneuploidía en embriones en desarrollo aumenta con el avance de la edad materna y es una causa importante de defectos congénitos, así como la pérdida del embarazo en mujeres 1,2, por lo tanto, lo que subraya una importante necesidad de comprender la base molecular de la aneuploidía durante la división meiótica . Durante la división celular, la segregación cromosómica depende crucialmente de montaje del huso mitótico microtúbulos y el establecimiento de interacciones del cromosoma microtúbulos estables para el correcto apego a husillo opuestopolos. Es importante destacar que la formación del huso meiótico en ovocitos de mamíferos difiere de la mitosis en las células somáticas, y está regulado por los centros de organización de microtúbulos (COMT) únicas que carecen de centriolos 3,4. Proteínas esenciales necesarios para la nucleación de microtúbulos y organización localizar a COMT ovocitos, incluyendo γ-tubulina que cataliza ensamblaje de los microtúbulos. Además, pericentrina funciona como un andamio de proteínas esenciales, que se une y anclajes gamma-tubulina, así como otros factores en COMT 5. En particular, nuestros estudios demuestran que el agotamiento de las proteínas asociadas-MTOC clave interrumpe organización huso meiótico y conduce a errores en la segregación cromosómica ovocitos, que no se resuelven por completo por el punto de control de ensamblaje del huso (SAC) 6,7. Por lo tanto, los defectos en la estabilidad del huso, que no provocan la detención meiótica, plantean un riesgo significativo para contribuir a la aneuploidía. A pesar de su papel esencial en el montaje y organización del huso, prot MTOC ovocitocomposición y función ein sigue siendo poco conocida. Prueba de la función de las proteínas diana específicas en ovocitos de mamíferos es un reto, ya que las células se vuelven transcripcionalmente inactiva poco antes de la reanudación de la meiosis 8,9. Por lo tanto, los ovocitos pre-ovulatorios se basan en tiendas de mRNA maternos para reanudar la meiosis y apoyan la división meiótica, así como las primeras divisiones de escisión después de la fertilización 10,11. La eficacia de la interferencia de ARN (RNAi) mediada por la degradación de transcritos de ARNm en ovocitos de mamíferos está bien establecido y RNAs maternas reclutados para la traducción durante la maduración meiótica son particularmente susceptibles de siRNA dirigidos 12-14. Por lo tanto, la microinyección de RNAs de interferencia cortos (siRNAs) en oocitos proporciona un enfoque valioso para agotar los ARNm diana para el ensayo funcional. A continuación, describimos los métodos para el aislamiento de los ovocitos de ratón y el agotamiento de siRNA mediada por transcri específicapts para probar la función de una proteína esencial asociada a MTOC, pericentrina. Además, se describen condiciones de análisis de inmunofluorescencia para evaluar la formación del huso meiótico en ovocitos.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
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			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
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meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

La microinyección de siRNAs proporciona un enfoque eficaz para la degradación del ARNm y el agotamiento de la proteína posterior en oocitos, que permite a las pruebas funcionales eficiente y altamente específica de diferentes factores diana in vitro. Posteriormente, la inmunofluorescencia se utiliza para el análisis específico fenotipo, así como para validar el agotamiento de la proteína en oocitos inyectados con siRNA. En el ejemplo actual, marcaje fluorescente de ovocitos individuales con DAPI junto c...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vistas.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos. 

Video: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transferencia nuclear en ovocitos de ratón

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Investigación

Biología

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Recuperación de los ovocitos de ratón

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolección y criopreservación de ovocitos de hámster y de embriones de ratón

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...