This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Georgia. 1. Preparativos <ol><li> Para el cultivo de los ovocitos, compra o recién preparar Medio Esencial Mínimo (MEM) y complementar con 3 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) como se indica en la Tabla 1. Coloque una botella de poliestireno en un equilibrio de carga (tara a cero). Añadir todos los reactivos, excepto BSA, en orden y que aparezca el volumen final con MQ-agua en peso a un total de 250 g. A continuación, agregue la BSA, deje que se disuelva y esterilizar filtro. Nota: El medio MEM descrito requiere de equilibración y la incubación de células con una mezcla de gases médica de 5% de CO 2, 5% O 2 y 90% N 2. Sin embargo, otros medios de comunicación (por ejemplo, CZB) se pueden usar que permiten la incubación de las células en 5% de CO 2 en condiciones atmosféricas. </li><li> Para la microinyección de ovocitos, comprar o preparar medio M2. </li><li> Preparar pgonadotropina de suero de yegua reinante (PMSG) a una concentración de 5 UI / 100 l. </li><li> Compra y reconstituir las reservas siRNA a una concentración de trabajo de 1 mM. </li></ol> 2. ratón ovocitos Colección <ol><li> DÍA 1: Para estimular el desarrollo del folículo ovárico y aumentar el número de folículos pre-ovulatorios, administrar 5 UI de PMSG por vía intraperitoneal a ratones hembra de 48 horas antes de la recolección de los ovocitos. </li><li> DÍA 3: Para la recolección de los ovocitos y la cultura, estableció placas de cultivo de 35 mm con 3 ml de MEM / BSA suplementado con 1 mg / ml milrinona. Este inhibidor de la fosfodiesterasa mantiene los ovocitos en profase I arreste y evita la ruptura de la vesícula germinal (GVBD). Equilibrar las placas de cultivo en una mezcla de gases médica durante al menos 15 min. Se requiere Milrinona medio suplementado en toda la colección de ovocitos, así como la microinyección de ovocitos y el 24 horas de retención cultura período posterior siRNA: Nota. </li><li> Recuperar los ovarios de los ratones hembra utilizando laboratorio establecido prácticas 15 y traslado a una nueva placa de cultivo con pre-calentado y se equilibró MEM / BSA / milrinona. </li><li> Coloque la placa de cultivo en el escenario de un microscopio estereoscópico para la recolección de los ovocitos. Lanzamiento de cúmulo-ovocito complejos (COC de) perforando manualmente los folículos antrales con 27 G agujas. Fijar un ovario a la parte inferior de la placa de cultivo, con una aguja de 27 G unida a una jeringa de 1 ml, y utilizar una segunda aguja para perforar todos los folículos grandes. Repita el procedimiento para cada ovario. </li><li> Usando procedimientos boca pipeteo estándar u otros medios de aspiración de ovocitos, recoger todos los ovocitos que están rodeados por 2 o más capas de células del cumulus compactos. Transferir el COC de un nuevo plato y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Retire con cuidado las células del cumulus que rodean por repetido pipeteo suave con una pipeta 1 ml ajustado a un volumen de aspiración de 750 l. Repita el paso de pipeteo cerca de 12 vecesy permitir que los ovocitos se recuperen durante 5 min. Continúe de esta manera hasta que todos o la mayoría de las células del cúmulo se han eliminado. La transferencia de los ovocitos denudados a otra placa de cultivo y permitir que se equilibre a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Asignar los ovocitos denudados en tres grupos experimentales que se utilizarán para: (i) la microinyección de siRNAs específicos contra el blanco de interés, (ii) la microinyección de (control) siRNAs inespecíficos, y (iii) un grupo no inyectada de control para tener en cuenta condiciones de cultivo. </li></ol> 3. La microinyección de ovocitos <ol><li> Establecer placas de cultivo con 3 ml de medio M2 suplementado con milrinona (1 mg / ml) para la microinyección de ovocitos. Preparar placas de cultivo que contenían MEM / BSA / milrinona para el lavado y la posterior cultura de ovocitos inyectados. Nota: medio M2 contiene HEPES tampón y requiere pre-calentamiento a 37 ° C durante 15 minutos en condiciones atmosféricas. MEM requiere pre-calentamiento y el equilibrio usando gases medicinales como describird arriba. </li><li> Prepare el sistema de microinyección. Cargue la aguja de inyección con 5 l de solución de siRNA 1 M. Asegure la pipeta de sujeción y la aguja de inyección para micromanipuladores del sistema de microinyección y configurar la unidad de inyección con el volumen y la presión calibrada. </li><li> Coloque un 200 l micro-gota de medios M2 en el interior de la tapa de una placa de cultivo de 3 cm y añadir un ovocito para configurar y alineación del sistema de microinyección. </li><li> Utilizando el ovocito como guía, ajuste las posiciones de la explotación y de inyección de agujas. Aplicar presión negativa a la pipeta de sujeción para fijar suavemente el ovocito y ajustar la posición de la aguja de inyección con el diámetro más ancho de la célula. Ajustar la configuración para permitir que la microinyección de aproximadamente 10 pl de la solución de siRNA en cualquier lugar en el citoplasma del ovocito. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. ovocitos microinyección creó. ( <strong&gt; A) imagen representativa de una micro-200 l gota de medios de comunicación M2 colocado en la tapa de una placa de cultivo de 3 cm, con la aguja de sujeción de la pipeta y la inyección colocado a la izquierda y derecha, respectivamente. (B) Grupo de la profase I arrestado ovocitos (GV-etapa) antes de la microinyección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </li><li> Devuelva la tapa para la etapa de microscopio estereoscópico y añadir un 200 l micro-gota de medios M2 fresco. Añadir un grupo de ovocitos (~ 10) a la micro-gota mediante pipeteo boca, o métodos alternativos, a continuación, devolver la tapa con micro-gota a la etapa de microinyección. <ol><li> Proceda a microinyectar los ovocitos individuales. Asegurar un ovocito con la pipeta tenencia, introduzca lentamente la punta de la aguja de inyección en el citoplasma y expulsar el volumen de inyección de la solución de siRNA. Retraer con cuidado la aguja de inyección y move el oocito inyectado a una posición en la parte inferior de la micro-drop. Mueva ovocitos inyectados, sin éxito, a una posición en la parte superior de la micro-drop. </li><li> Repita el procedimiento de microinyección con cada ovocito. Para mantener la viabilidad de oocitos óptima, microinyectar sólo un pequeño número de ovocitos a la vez. Asegúrese de que este proceso no toma más de unos pocos minutos para evitar que la temperatura y pH cambios en la micro-drop. </li></ol></li><li> Aspirar inyecta éxito ovocitos o mover con cuidado la tapa con el micro-gota de ovocitos inyectados con el microscopio estereoscópico. La transferencia de los ovocitos viables inyectados con la pipeta boca o métodos alternativos, al MEM / BSA medio / milrinona de lavar y equilibrar a 37 ° C. </li><li> El uso de otro grupo de ovocitos, repita el proceso de microinyección con una nueva aguja de inyección cargado con siRNAs no específicos para el grupo de control. Lave los ovocitos en MEM / BSA / milrinona y traslado a una placa de cultivo separado. </li><li> Cultura todos los grupos deovocitos durante 24 horas en MEM / BSA / milrinona a 37 ° C en una atmósfera de gas médico. Nota: Se necesita el periodo de cultivo &#39;bloque milrinona&#39; para la meta eficiente agotamiento ARNm / proteína. </li></ol> 4. ovocitos de la cultura para la maduración meiótica <ol><li> DÍA 4: Para cada grupo experimental de ovocitos configuración 4 placas de cultivo (35 mm) con 3 ml de MEM / BSA. Suplemento un plato medios por grupo con 10% de suero bovino fetal (de alta calidad) (FBS) a utilizar para la maduración de ovocitos. Permitir que todos los platos de cultivo se equilibren a 37 ° C con la mezcla de gases medicinales. </li><li> Para liberar ovocitos de &quot;bloque milrinona &#39;, secuencialmente lavar los ovocitos tres veces en platos que contienen MEM / BSA y luego transferir los ovocitos al plato que contiene la maduración de medios con 10% de FBS. Cultura todos los grupos de ovocitos de 17 horas a 37 ° C, para permitir la reanudación y la progresión de la meiosis. </li><li> DÍA 5: Preparar soluciones para fixa ovocitoción, incluyendo: (i) 4% de paraformaldehído (PFA) en tampón PEM (TUBOS 100 mM [pH 6,9], 1 mM de MgCl 2, 1 mM EGTA) con 0,5% de Triton-X 100, y (ii) PBS suplementado con 5 % de FBS que se utilizarán para lavar y bloquear los ovocitos. Nota: Estas soluciones requieren pre-calentamiento a 37 ° C antes de la fijación de los ovocitos. </li><li> Para la fijación de los ovocitos (después del cultivo 17 hr), con rapidez transferir cada grupo experimental de los oocitos mediante pipeteado boca o métodos alternativos en los pocillos individuales (de un plato de 4 pocillos) que contiene 750 l de pre-calentado solución PFA 4% y se incuba a 37 ° C durante 1 hora. Posteriormente lavar cada grupo de ovocitos 3 veces (15 min cada uno) en 750 l de PBS precalentado que contienen 5% de FBS. </li><li> Ovocitos bloque en 200 l de PBS / 5% de FBS O / N a 4 ° C para minimizar la unión inespecífica del anticuerpo. </li></ol> Análisis 5. Inmunofluorescencia <ol><li> DÍA 6: Nota: La inmunotinción se realiza en una placa multi-pocillo y la OOCytes se transfieren en serie a los pocillos secuenciales, que contiene respectivas soluciones de anticuerpos y de lavado. Cualquiera de 48 o 96 pocillos placas se pueden usar, simplemente ajustar el volumen de la solución basada en el tamaño también. Para placas de 96 pocillos utilizar 200 l por pocillo. Los ovocitos se transfieren a las diferentes soluciones en el orden siguiente: solución de anticuerpo primario - 3 pozos de lavado - solución de anticuerpo secundario - 3 pozos de lavado. Para limitar exposición a la luz de la placa se puede cubrir con papel de aluminio. Preparar fresco PBS / 5% de FBS y utilizar esta solución para preparar diluciones de anticuerpos (por ejemplo, conejo anti-pericentrina (1 / 1.000), ratón anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> La transferencia de los ovocitos fijos de cada grupo experimental a los pocillos individuales que contienen 200 l (o 100 l, si se desea menos volumen) de la solución de anticuerpo primario y tapar el pozo con parafilm. Incubar acuerdo con las condiciones óptimas de anticuerpo específico (por ejemplo, 37 ° C durante 1 hr, o 4 ° CO / N). Nota: El anticuerpo primario dilution así como el tiempo de incubación y la temperatura específica requieren pruebas para determinar las condiciones óptimas para diferentes anticuerpos utilizados. </li><li> Después de la incubación con el anticuerpo primario, se lavan los ovocitos tres veces en PBS / FBS al 5% (10-15 min cada uno). </li><li> La transferencia de los ovocitos en la solución que contiene anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia (por ejemplo, 1 / 1.000 de dilución de anticuerpos anti-conejo y anti-ratón conjugado con fluorocromos de diferentes longitudes de onda). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar los ovocitos tres veces en PBS / FBS al 5% (10 - 15 min cada uno). </li><li> Tras la etapa de lavado final, la transferencia de los ovocitos en un portaobjetos de vidrio limpio y suavemente aspirar cualquier exceso de solución de lavado. Esto inmovilizar los ovocitos en la superficie de vidrio. Añadir 8 l de los medios de comunicación (que contiene DAPI) montaje y superponer cuidadosamente los medios de montaje con un 22 mm x 22 mm cubreobjetos. Baje el cubreobjetos lentamente para evitar atrapar burbujas de aire y / o dañar los ovocitos. Nota: Como alternativa, para mantener las propiedades 3-dimensionales de los ovocitos para el análisis de microscopía confocal, añadir un pequeño volumen de 100 cuentas de vidrio micras (mezclado con vaselina) a las esquinas de la hoja de la cubierta antes de montar en la diapositiva. </li><li> Diapositivas se almacenan a 4 ° C, o proceder a la evaluación de la progresión meiótica, así como el análisis de los niveles de expresión y localización subcelular de proteínas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros necesarios para que coincida con los anticuerpos secundarios utilizados. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. 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The authors have nothing to disclose

Si bien hay varios métodos para la transferencia de ácido nucleico exógeno en las células somáticas, tales como la electroporación y la transfección, microinyección es el método óptimo para la entrega de moléculas de RNA en oocitos de ratón transcripcionalmente quiescentes. El protocolo actual ofrece un enfoque eficaz para el agotamiento in vitro de ARNm específicos que permiten a las pruebas funcionales de diferente huso y / o factores MTOC asociada en ovocitos. Este enfoque se traduce en el agota...

La meiosis es un proceso de división único que ocurre en gametos (ovocitos y espermatozoides) y consiste en dos divisiones sucesivas sin intervenir la síntesis de ADN para segregar los cromosomas homólogos y cromátidas hermanas durante la meiosis I y meiosis II, respectivamente 1. Los errores en la segregación cromosómica durante la división meiótica en ovocitos pueden dar lugar a aneuploidía, que se hereda por el embrión durante la fertilización. En particular, la incidencia de la aneuploidía en embriones en desarrollo aumenta con el avance de la edad materna y es una causa importante de defectos congénitos, así como la pérdida del embarazo en mujeres 1,2, por lo tanto, lo que subraya una importante necesidad de comprender la base molecular de la aneuploidía durante la división meiótica . Durante la división celular, la segregación cromosómica depende crucialmente de montaje del huso mitótico microtúbulos y el establecimiento de interacciones del cromosoma microtúbulos estables para el correcto apego a husillo opuestopolos. Es importante destacar que la formación del huso meiótico en ovocitos de mamíferos difiere de la mitosis en las células somáticas, y está regulado por los centros de organización de microtúbulos (COMT) únicas que carecen de centriolos 3,4. Proteínas esenciales necesarios para la nucleación de microtúbulos y organización localizar a COMT ovocitos, incluyendo γ-tubulina que cataliza ensamblaje de los microtúbulos. Además, pericentrina funciona como un andamio de proteínas esenciales, que se une y anclajes gamma-tubulina, así como otros factores en COMT 5. En particular, nuestros estudios demuestran que el agotamiento de las proteínas asociadas-MTOC clave interrumpe organización huso meiótico y conduce a errores en la segregación cromosómica ovocitos, que no se resuelven por completo por el punto de control de ensamblaje del huso (SAC) 6,7. Por lo tanto, los defectos en la estabilidad del huso, que no provocan la detención meiótica, plantean un riesgo significativo para contribuir a la aneuploidía. A pesar de su papel esencial en el montaje y organización del huso, prot MTOC ovocitocomposición y función ein sigue siendo poco conocida. Prueba de la función de las proteínas diana específicas en ovocitos de mamíferos es un reto, ya que las células se vuelven transcripcionalmente inactiva poco antes de la reanudación de la meiosis 8,9. Por lo tanto, los ovocitos pre-ovulatorios se basan en tiendas de mRNA maternos para reanudar la meiosis y apoyan la división meiótica, así como las primeras divisiones de escisión después de la fertilización 10,11. La eficacia de la interferencia de ARN (RNAi) mediada por la degradación de transcritos de ARNm en ovocitos de mamíferos está bien establecido y RNAs maternas reclutados para la traducción durante la maduración meiótica son particularmente susceptibles de siRNA dirigidos 12-14. Por lo tanto, la microinyección de RNAs de interferencia cortos (siRNAs) en oocitos proporciona un enfoque valioso para agotar los ARNm diana para el ensayo funcional. A continuación, describimos los métodos para el aislamiento de los ovocitos de ratón y el agotamiento de siRNA mediada por transcri específicapts para probar la función de una proteína esencial asociada a MTOC, pericentrina. Además, se describen condiciones de análisis de inmunofluorescencia para evaluar la formación del huso meiótico en ovocitos.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare&#039;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recipe outlined in Table 1</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G, potassium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Essential Amino Acids (50x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs targeting Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Micro-injections System</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulators</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injection needles (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Holding pipettes (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA Filter System</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

La microinyección de siRNAs proporciona un enfoque eficaz para la degradación del ARNm y el agotamiento de la proteína posterior en oocitos, que permite a las pruebas funcionales eficiente y altamente específica de diferentes factores diana in vitro. Posteriormente, la inmunofluorescencia se utiliza para el análisis específico fenotipo, así como para validar el agotamiento de la proteína en oocitos inyectados con siRNA. En el ejemplo actual, marcaje fluorescente de ovocitos individuales con DAPI junto c...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

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11.6K vistas.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos. 

Video: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Investigación

Genética

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

Evaluación de la madurez del óvulo humano y su aplicación clínica

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Biología del Desarrollo

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at prophase I of the first meiotic division. After puberty and upon meiotic resumption, the nuclear membrane disassembles (nuclear envelope breakdown), and the spindle is assembled mainly at the oocyte center. Initial central spindle positioning is essential to protect against abnormal kinetochore-microtubule (MT) attachments and aneuploidy. The centrally positioned spindle migrates in a time-sensitive manner toward the cortex, and this is a necessary process to extrude a tiny polar body. In mitotic cells, spindle positioning relies on the interaction between centrosome-mediated astral MTs and the cell cortex. On the contrary, mouse oocytes lack classic centrosomes and, instead, contain numerous acentriolar MT organizing centers (MTOCs). At the metaphase I stage, mouse oocytes have two different sets of MTOCs: (1) MTOCs that are clustered and sorted to assemble spindle poles (polar MTOCs), and (2) metaphase cytoplasmic MTOCs (mcMTOCs) that remain in the cytoplasm and do not contribute directly to spindle formation but play a crucial role in regulating spindle positioning and timely spindle migration. Here, a multi-photon laser ablation method is described to selectively deplete endogenously labeled mcMTOCs in oocytes collected from Cep192-eGfp reporter mice. This method contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying spindle positioning and migration in mammalian oocytes.

An optimized protocol is presented that enables the depletion of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes during metaphase I using a near-infrared femtosecond laser.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Identificación del daño en el ADN en ovocitos de ratones con profase detenida

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor destacado: Comprensión de la respuesta al daño del ADN en ovocitos de mamíferos y embriones preimplantacionales 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

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Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Uso de ovocitos de ratón para evaluar la función humana del Gene durante la Meiosis I

Uso de la sola molécula fluorescente en Situ del hibridación (SM-pescado) para cuantificar y Localize mRNAs en oocitos murinos

Evaluación de la madurez del óvulo humano y su aplicación clínica

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

Detección de roturas de ADN bicatenario en ovocitos de ratón

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía