This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Geórgia. 1. Preparativos <ol><li> Para a cultura de oócitos, ou acabado de preparar a compra Meio Essencial Mínimo (MEM) e completar com 3 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) tal como delineado na Tabela 1. Colocar uma garrafa de poliestireno em um equilíbrio de carga (tara a zero). Adicionar todos os reagentes, exceto BSA, em ordem e trazer o volume final com o MQ-água, em peso, para um total de 250 g. Em seguida, adicionar o BSA, para permitir dissolver e esterilizar filtro. Nota: O meio MEM descrito requer equilíbrio e a incubação de células com uma mistura de gases medicinais de 5% de CO 2, 5% de O2 e 90% de N2. No entanto, outros meios de comunicação (por exemplo, CZB) pode ser usado para permitir que a incubação de células em 5% de CO2 sob condições atmosféricas. </li><li> Para microinjeção de oócitos, comprar ou preparar o meio M2. </li><li> Prepare pde soro de gonadotropina de égua reinante (PMSG) a uma concentração de 5 IU / 100 ul. </li><li> Compra e reconstituir estoques de siRNA para uma concentração de trabalho de 1 uM. </li></ol> 2. Rato Oocyte Colecção <ol><li> DIA 1: Para estimular o desenvolvimento folicular ovariano e aumentar o número de folículos pré-ovulatórios, administrar 5 IU de PMSG intraperitoneal a ratos do sexo feminino de 48 horas antes da coleta de oócitos. </li><li> DIA 3: Para a coleta de oócitos e cultura, um aumento de 35 mm placas de cultura com 3 ml de MEM / BSA suplementado com 1 mg / ml milrinona. Este inibidor da fosfodiesterase mantém os oócitos em prophase-I prender e evita rompimento da vesícula germinativa (GVBD). Equilibrar as placas de cultura de uma mistura de gases medicinais para, pelo menos, 15 min. Nota: Milrinona meio suplementado é necessária durante todo coleta de oócitos, bem como a microinjeção de oócitos e a 24 hr cultura hold período pós siRNA. </li><li> Recuperar os ovários de camundongos fêmeas usando laboratório estabelecido pratica 15 e transfira para uma nova cultura prato com pré-aquecido e equilibrada MEM / BSA / milrinona. </li><li> Coloque a placa de cultura no palco de um microscópio estereoscópico para coleta de ovócitos. Datas de cumulus-oócito (COC-complexos de) por punção manualmente os folículos antrais com 27 agulhas G. Fixar um ovário para a parte inferior da placa de cultura, com uma agulha de 27 G ligada a uma seringa de 1 ml, e utilizar uma segunda agulha para perfurar todos os folículos grandes. Repita o procedimento para cada ovário. </li><li> Usando procedimentos boca pipetagem padrão ou outros meios de aspiração de oócitos, recolher todos os oócitos que são cercados por 2 ou mais camadas de células do cumulus compactas. Transferir a COC de novo para um prato e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Remova cuidadosamente os cercam as células do cumulus por pipetagem suave repetido com uma pipeta 1 ml ajustado para um volume de aspiração de 750 mL. Repita o passo de pipetagem cerca de 12 vezese permitir que os oócitos a recuperar durante 5 min. Continuar dessa maneira até que todas ou a maioria das células do cumulus foram removidas. Transferir os oócitos desnudadas para outro prato de cultura e deixar equilibrar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Atribuir os oócitos desnudados em três grupos experimentais a ser utilizado para: (i) microinjecção de siRNAs específicos contra o alvo de interesse, (ii) microinjecção de inespecíficas (controlo) siRNAs, e (iii) um grupo não-injectados de controlo para contabilizar condições de cultura. </li></ol> 3. Oocyte Microinjection <ol><li> Colocação em placas de cultura com 3 ml de meio M2 suplementado com milrinona (1 ug / ml) para microinjecção de oócitos. Prepare pratos de cultura contendo MEM / BSA / milrinone para lavar e cultura subsequente de oócitos injectados. Nota: meio M2 contém tampão HEPES e requer pré-aquecimento a 37 ° C durante 15 minutos, sob condições atmosféricas. MEM exige pré-aquecimento e de equilíbrio utilizando gás medicinal como descreverd acima. </li><li> Prepara-se o sistema de micro-injecção. Coloque a agulha de injeção com 5 ml de solução de siRNA específico 1 ï¿½. Fixe a pipeta de exploração e agulha de injeção para micromanipuladores do sistema de microinjeção e configurar a unidade de injeção com volume e pressão calibrada. </li><li> Coloque uma micro-gota de 200 mL de suporte M2 no interior da tampa de um prato de cultura de 3 cm e adicionar um oócito para configurar e de alinhamento do sistema de micro-injecção. </li><li> Usando o oócito como um guia, ajustar as posições da exploração e de injeção de agulhas. Aplicar pressão negativa para a pipeta de retenção para fixar suavemente o oócito e ajustar a posição da agulha de injecção para o maior diâmetro da célula. Ajustar configurações para permitir a microinjecção de cerca de 10 ul da solução de siRNA em qualquer lugar no citoplasma dos oócitos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. Oocyte microinjeção configurar. ( <strong&gt; A) Imagem representativa de uma micro-gota de M2 meios 200 ul colocado sobre a tampa de uma placa de cultura de 3 cm, com a pipeta de retenção da agulha e de injecção posicionados à esquerda e à direita, respectivamente. (B) Grupo de prophase-I preso oócitos (GV-estágio) antes da microinjeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> E volta a tampa para a fase estereomicroscópio e adicionar uma micro-gota de 200 mL de suporte M2 fresco. Adicionar um grupo de oócitos (~ 10) para o micro-gota a pipeta boca, ou métodos alternativos, em seguida, retornar a tampa com micro-gota para a fase de microinjeção. <ol><li> Prossiga para microinject os oócitos individuais. Fixar um ovócito com a pipeta, segurando, inserir-se lentamente a ponta da agulha de injecção para dentro do citoplasma e expulsar o volume de injecção de solução de siRNA. Retraia cuidadosamente a agulha de injeção e move o oócito injectado para uma posição, na parte inferior do micro-gota. Mover os oócitos injectados, sem sucesso, para uma posição no topo do micro-gota. </li><li> Repita o procedimento de microinjeção com cada ovócito. Para manter a viabilidade dos oócitos óptima, microinject apenas um pequeno número de oócitos de cada vez. Assegure-se que este processo não leva mais do que alguns minutos, para evitar mudanças de temperatura e pH no micro-gota. </li></ol></li><li> Aspirar oócitos injectados com sucesso ou mover-se cuidadosamente a tampa com o micro-gota de oócitos injectados com o estereomicroscópio. Transferir os oócitos viáveis ​​injectados por pipetagem boca ou métodos alternativos, para MEM / BSA a forma / milrinona para lavar e equilibrar-se a 37 ° C. </li><li> Usando um outro grupo de oócitos, repita o processo de microinjeção com uma nova agulha de injeção carregado com siRNAs não específicas para o grupo controle. Lavar os ovócitos em MEM / BSA / milrinona e transferência para uma cultura prato separado. </li><li> Cultura todos os grupos deoócitos durante 24 horas em MEM / BSA / milrinona a 37 ° C sob uma atmosfera de gás médico. Nota: O período de cultura &#39;bloco milrinona&#39; é necessário para alvo eficiente esgotamento mRNA / proteína. </li></ol> 4. Oocyte Cultura para maturação meiótica <ol><li> Dia 4: Para cada grupo experimental de oócitos set-up 4 pratos de cultura (35 mm) com 3 ml de MEM / BSA. Suplemento um prato meios por grupo com 10% (alta qualidade) de soro fetal de bovino (FBS) a ser usado para a maturação do oócito. Permitir que todos os pratos de cultura para equilibrar a 37 ° C com mistura de gases medicinais. </li><li> Para libertar a partir de oócitos &#39;bloco milrinona&#39;, sequencialmente lavar os oócitos três vezes em placas contendo MEM / BSA e depois transferir os oócitos para o prato de maturação contendo meio com FBS a 10%. Todos os grupos de cultura de oócitos durante 17 horas a 37 ° C, para permitir a retomada e progressão da meiose. </li><li> Dia 5: Preparar soluções para FIXA oócitoção, incluindo: (i) 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão PEM (100 mM PIPES [pH 6,9], MgCl 2 1 mM, EGTA 1 mM) com 0,5% de Triton-X 100, e (ii) de PBS suplementado com 5 % de FBS que vai ser usada para lavar e bloquear os oócitos. Nota: Estas soluções requerem pré-aquecimento a 37 ° C, antes da fixação do oócito. </li><li> Para a fixação do oócito (após a cultura de 17 horas), rapidamente transferir cada grupo experimental de oócitos por pipetagem boca ou métodos alternativos em poços individuais (de um 4-bem prato) contendo 750 ul de pré-aquecido solução PFA a 4% e incubar a 37 ° C durante 1 h. Subsequentemente lavar cada grupo de oócitos de 3 vezes (15 minutos cada) em 750 ul de PBS pré-aquecido contendo 5% de FBS. </li><li> Oócitos de bloco em 200 ul de PBS / FBS a 5% O / N a 4 ° C para minimizar a ligação não específica de anticorpos. </li></ol> 5. Análise de imunofluorescência <ol><li> DIA 6: Nota: A imunocoloração é feito de uma placa multi-poços e o OOCytes são serialmente transferidos para poços sequenciais, contendo as respectivas soluções de anticorpos e de lavagem. 48 ou placas de 96 poços pode ser usado, basta ajustar o volume da solução com base no tamanho bem. Para placas de 96 poços utilizar 200 ul por poço. Os oócitos são transferidos para as diferentes soluções pela seguinte ordem: solução de anticorpo primário - 3 - da solução de lavagem de poços anticorpo secundário - 3 poços de lavagem. Para limitar a exposição à luz a placa pode ser coberto com a folha. Preparar uma solução de PBS / 5% de FBS e usar esta solução para preparar as diluições de anticorpos (por exemplo, de coelho anti-pericentrin (1 / 1.000), de ratinho anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> Transferir os oócitos fixos de cada grupo experimental para poços individuais contendo 200 uL (ou 100 uL, se é desejada menos volume) da solução de anticorpo primário e cobrir o poço com parafilme. Incubar de acordo com as condições específicas do anticorpo óptimas (por exemplo, 37 ° C durante 1 hora, ou 4 ° CO / N). Nota: O anticorpo primário dilution, bem como o tempo de incubação específico e temperatura exigem testes para determinar as condições ideais para diferentes anticorpos utilizados. </li><li> Após a incubação com o anticorpo primário, os oócitos lavar três vezes em PBS / FBS a 5% (10-15 min cada). </li><li> Transferir os oócitos na solução contendo anticorpos secundários conjugados com fluorescência (por exemplo, 1 / 1.000 a diluição dos anticorpos anti-coelho e anti-murganho conjugados com fluorocromos de diferentes comprimentos de onda). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar os oócitos três vezes em PBS / FBS a 5% (10 - 15 min cada). </li><li> Após o passo final de lavagem, transferir os oócitos em uma lâmina de vidro limpa e delicadamente aspirar qualquer solução de lavagem em excesso. Isto vai imobilizar os oócitos na superfície do vidro. Adicionar 8 mL de mídia (contendo DAPI) de montagem e sobrepor cuidadosamente a mídia de montagem com uma 22 mm x 22 milímetros lamela. Abaixe a lamela lentamente para evitar bolhas de interceptação e / ou danificar os ovócitos. Nota: Alternativamente, para manter as propriedades de 3-dimensionais do oócito para análise de microscopia confocal, adicionar um pequeno volume de esferas de vidro de 100 uM (misturado com geleia de petróleo) para os cantos da lâmina de cobertura antes da montagem sobre a lâmina. </li><li> Armazenar as lâminas a 4 ° C, ou prosseguir para a avaliação de progressão meiótica, bem como a análise dos níveis de expressão e localização subcelular da proteína utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros necessárias para coincidir com os anticorpos secundários utilizados. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Embora existam vários métodos para a transferência de ácido nucleico exógeno em células somáticas, tais como a electroporação e a transfecção, microinjecção é o método ideal para a administração de moléculas de ARN em oócitos de rato transcricionalmente quiescentes. O protocolo atual fornece uma abordagem eficaz para in vitro esgotamento de mRNAs específicos que permitem que o teste funcional de diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos. Esta abordagem resulta em esgotame...

A meiose é um processo de divisão única que ocorre em gametas (óvulos e espermatozóides) e envolve duas divisões sucessivas sem intervir síntese de DNA para separar cromossomos homólogos e cromátides irmãs durante a meiose-I e meiose-II, respectivamente 1. Erros na segregação dos cromossomos durante a divisão da meiose em oócitos pode resultar em aneuploidia, que é herdado pelo embrião durante a fertilização. Notavelmente, a incidência de aneuploidia em embriões em desenvolvimento aumenta com o avançar da idade materna e é uma causa principal de defeitos congénitos congénitas, bem como a perda da gravidez em mulheres 1,2, assim, uma necessidade importante sublinhar a compreender a base molecular de aneuploidia durante a divisão meiótica . Durante a divisão celular, a segregação cromossômica depende fundamentalmente da montagem do aparelho do fuso microtúbulos e estabelecimento de interações cromossômicas-microtúbulos estáveis ​​para a correta fixação ao eixo opostopólos. É importante ressaltar que a formação do fuso meiótico em ovócitos de mamíferos difere da mitose em células somáticas, e é regulada por centros de organização de microtúbulos únicos (MTOCs) que não possuem centríolos 3,4. Proteínas essenciais necessárias para a nucleação de microtúbulos e organização para localizar MTOCs ovócitos, incluindo γ-tubulina que catalisa a montagem de microtúbulos. Além disso, pericentrin funciona como uma proteína essencial andaime, que se liga e âncoras y-tubulina, bem como de outros factores na MTOCs 5. Notavelmente, os nossos estudos mostram que a depleção de proteínas principais associadas interrompe-MTOC organização fuso meiótico e conduz a erros de segregação cromossoma em oócitos, que não são inteiramente resolvidas pelo posto de montagem do eixo (SAC) 6,7. Portanto, defeitos de estabilidade do fuso, que não provocam detenção meiótica, representam um risco significativo na contribuição para a aneuploidia. Apesar de seu papel essencial na montagem do fuso e organização, prot MTOC oócitocomposição e função ein permanece pouco compreendida. Testando a função de proteínas alvo específicas em oócitos de mamíferos é um desafio, como as células tornam-se transcricionalmente quiescente pouco antes do recomeço da meiose 8,9. Assim, os oócitos pré-ovulatórios dependem lojas de ARNm maternais para retomar a meiose e a apoiar divisão meiótica, bem como as primeiras divisões de clivagem após a fertilização 10,11. A eficácia de interferência de RNA (RNAi) degradação mediada de transcritos de mRNA em oócitos de mamíferos está bem estabelecida e RNAs maternas recrutados para a tradução durante a maturação meiótica são particularmente passível de siRNA alvejando 12-14. Portanto, a microinjecção de RNAs interferentes curtas (siARN) em oócitos fornece uma ferramenta valiosa para esgotar mRNAs alvo para testes funcionais. Aqui, descrevemos métodos para o isolamento de oócitos de camundongos e esgotamento mediado por siRNA de transcri específicopts para testar a função de uma proteína essencial MTOC-associado, pericentrin. Além disso, descreve-se as condições de análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótica em oócitos.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare&#039;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recipe outlined in Table 1</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G, potassium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Essential Amino Acids (50x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs targeting Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Micro-injections System</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulators</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injection needles (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Holding pipettes (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA Filter System</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

A microinjecção de siRNAs proporciona uma abordagem eficaz para a degradação de ARNm e proteína subsequente depleção em oócitos, que permite o teste funcional eficiente e altamente específico de diferentes factores alvo in vitro. Subsequentemente, a imunofluorescência é utilizado para a análise de fenótipo específico, bem como para validar a depleção de proteínas em oócitos injectados com siRNA. No exemplo atual, marcação fluorescente de oócitos individuais com DAPI em conjunto com anticorp...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

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Biology

11.6K visualizações.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos. 

Vídeo: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Genética

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

Avaliação da maturidade do ovo humano e sua aplicação clínica

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Biologia do Desenvolvimento

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at prophase I of the first meiotic division. After puberty and upon meiotic resumption, the nuclear membrane disassembles (nuclear envelope breakdown), and the spindle is assembled mainly at the oocyte center. Initial central spindle positioning is essential to protect against abnormal kinetochore-microtubule (MT) attachments and aneuploidy. The centrally positioned spindle migrates in a time-sensitive manner toward the cortex, and this is a necessary process to extrude a tiny polar body. In mitotic cells, spindle positioning relies on the interaction between centrosome-mediated astral MTs and the cell cortex. On the contrary, mouse oocytes lack classic centrosomes and, instead, contain numerous acentriolar MT organizing centers (MTOCs). At the metaphase I stage, mouse oocytes have two different sets of MTOCs: (1) MTOCs that are clustered and sorted to assemble spindle poles (polar MTOCs), and (2) metaphase cytoplasmic MTOCs (mcMTOCs) that remain in the cytoplasm and do not contribute directly to spindle formation but play a crucial role in regulating spindle positioning and timely spindle migration. Here, a multi-photon laser ablation method is described to selectively deplete endogenously labeled mcMTOCs in oocytes collected from Cep192-eGfp reporter mice. This method contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying spindle positioning and migration in mammalian oocytes.

An optimized protocol is presented that enables the depletion of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes during metaphase I using a near-infrared femtosecond laser.

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Identificando danos ao DNA em oócitos de camundongos com prisão de prófase

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor em destaque: Compreendendo a resposta a danos no DNA em oócitos de mamíferos e embriões pré-implantação 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Resumo

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Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Avaliação da maturidade do ovo humano e sua aplicação clínica

Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato

Ablação a Laser Multifóton de Centros Organizadores de Microtúbulos Citoplasmáticos em Oócitos de Camundongos

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Detecção de quebras de fita dupla de DNA em ovócitos de camundongos

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia