This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Geórgia. 1. Preparativos <ol><li> Para a cultura de oócitos, ou acabado de preparar a compra Meio Essencial Mínimo (MEM) e completar com 3 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) tal como delineado na Tabela 1. Colocar uma garrafa de poliestireno em um equilíbrio de carga (tara a zero). Adicionar todos os reagentes, exceto BSA, em ordem e trazer o volume final com o MQ-água, em peso, para um total de 250 g. Em seguida, adicionar o BSA, para permitir dissolver e esterilizar filtro. Nota: O meio MEM descrito requer equilíbrio e a incubação de células com uma mistura de gases medicinais de 5% de CO 2, 5% de O2 e 90% de N2. No entanto, outros meios de comunicação (por exemplo, CZB) pode ser usado para permitir que a incubação de células em 5% de CO2 sob condições atmosféricas. </li><li> Para microinjeção de oócitos, comprar ou preparar o meio M2. </li><li> Prepare pde soro de gonadotropina de égua reinante (PMSG) a uma concentração de 5 IU / 100 ul. </li><li> Compra e reconstituir estoques de siRNA para uma concentração de trabalho de 1 uM. </li></ol> 2. Rato Oocyte Colecção <ol><li> DIA 1: Para estimular o desenvolvimento folicular ovariano e aumentar o número de folículos pré-ovulatórios, administrar 5 IU de PMSG intraperitoneal a ratos do sexo feminino de 48 horas antes da coleta de oócitos. </li><li> DIA 3: Para a coleta de oócitos e cultura, um aumento de 35 mm placas de cultura com 3 ml de MEM / BSA suplementado com 1 mg / ml milrinona. Este inibidor da fosfodiesterase mantém os oócitos em prophase-I prender e evita rompimento da vesícula germinativa (GVBD). Equilibrar as placas de cultura de uma mistura de gases medicinais para, pelo menos, 15 min. Nota: Milrinona meio suplementado é necessária durante todo coleta de oócitos, bem como a microinjeção de oócitos e a 24 hr cultura hold período pós siRNA. </li><li> Recuperar os ovários de camundongos fêmeas usando laboratório estabelecido pratica 15 e transfira para uma nova cultura prato com pré-aquecido e equilibrada MEM / BSA / milrinona. </li><li> Coloque a placa de cultura no palco de um microscópio estereoscópico para coleta de ovócitos. Datas de cumulus-oócito (COC-complexos de) por punção manualmente os folículos antrais com 27 agulhas G. Fixar um ovário para a parte inferior da placa de cultura, com uma agulha de 27 G ligada a uma seringa de 1 ml, e utilizar uma segunda agulha para perfurar todos os folículos grandes. Repita o procedimento para cada ovário. </li><li> Usando procedimentos boca pipetagem padrão ou outros meios de aspiração de oócitos, recolher todos os oócitos que são cercados por 2 ou mais camadas de células do cumulus compactas. Transferir a COC de novo para um prato e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Remova cuidadosamente os cercam as células do cumulus por pipetagem suave repetido com uma pipeta 1 ml ajustado para um volume de aspiração de 750 mL. Repita o passo de pipetagem cerca de 12 vezese permitir que os oócitos a recuperar durante 5 min. Continuar dessa maneira até que todas ou a maioria das células do cumulus foram removidas. Transferir os oócitos desnudadas para outro prato de cultura e deixar equilibrar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Atribuir os oócitos desnudados em três grupos experimentais a ser utilizado para: (i) microinjecção de siRNAs específicos contra o alvo de interesse, (ii) microinjecção de inespecíficas (controlo) siRNAs, e (iii) um grupo não-injectados de controlo para contabilizar condições de cultura. </li></ol> 3. Oocyte Microinjection <ol><li> Colocação em placas de cultura com 3 ml de meio M2 suplementado com milrinona (1 ug / ml) para microinjecção de oócitos. Prepare pratos de cultura contendo MEM / BSA / milrinone para lavar e cultura subsequente de oócitos injectados. Nota: meio M2 contém tampão HEPES e requer pré-aquecimento a 37 ° C durante 15 minutos, sob condições atmosféricas. MEM exige pré-aquecimento e de equilíbrio utilizando gás medicinal como descreverd acima. </li><li> Prepara-se o sistema de micro-injecção. Coloque a agulha de injeção com 5 ml de solução de siRNA específico 1 ï¿½. Fixe a pipeta de exploração e agulha de injeção para micromanipuladores do sistema de microinjeção e configurar a unidade de injeção com volume e pressão calibrada. </li><li> Coloque uma micro-gota de 200 mL de suporte M2 no interior da tampa de um prato de cultura de 3 cm e adicionar um oócito para configurar e de alinhamento do sistema de micro-injecção. </li><li> Usando o oócito como um guia, ajustar as posições da exploração e de injeção de agulhas. Aplicar pressão negativa para a pipeta de retenção para fixar suavemente o oócito e ajustar a posição da agulha de injecção para o maior diâmetro da célula. Ajustar configurações para permitir a microinjecção de cerca de 10 ul da solução de siRNA em qualquer lugar no citoplasma dos oócitos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Figura 1. Oocyte microinjeção configurar. ( <strong&gt; A) Imagem representativa de uma micro-gota de M2 meios 200 ul colocado sobre a tampa de uma placa de cultura de 3 cm, com a pipeta de retenção da agulha e de injecção posicionados à esquerda e à direita, respectivamente. (B) Grupo de prophase-I preso oócitos (GV-estágio) antes da microinjeção. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> E volta a tampa para a fase estereomicroscópio e adicionar uma micro-gota de 200 mL de suporte M2 fresco. Adicionar um grupo de oócitos (~ 10) para o micro-gota a pipeta boca, ou métodos alternativos, em seguida, retornar a tampa com micro-gota para a fase de microinjeção. <ol><li> Prossiga para microinject os oócitos individuais. Fixar um ovócito com a pipeta, segurando, inserir-se lentamente a ponta da agulha de injecção para dentro do citoplasma e expulsar o volume de injecção de solução de siRNA. Retraia cuidadosamente a agulha de injeção e move o oócito injectado para uma posição, na parte inferior do micro-gota. Mover os oócitos injectados, sem sucesso, para uma posição no topo do micro-gota. </li><li> Repita o procedimento de microinjeção com cada ovócito. Para manter a viabilidade dos oócitos óptima, microinject apenas um pequeno número de oócitos de cada vez. Assegure-se que este processo não leva mais do que alguns minutos, para evitar mudanças de temperatura e pH no micro-gota. </li></ol></li><li> Aspirar oócitos injectados com sucesso ou mover-se cuidadosamente a tampa com o micro-gota de oócitos injectados com o estereomicroscópio. Transferir os oócitos viáveis ​​injectados por pipetagem boca ou métodos alternativos, para MEM / BSA a forma / milrinona para lavar e equilibrar-se a 37 ° C. </li><li> Usando um outro grupo de oócitos, repita o processo de microinjeção com uma nova agulha de injeção carregado com siRNAs não específicas para o grupo controle. Lavar os ovócitos em MEM / BSA / milrinona e transferência para uma cultura prato separado. </li><li> Cultura todos os grupos deoócitos durante 24 horas em MEM / BSA / milrinona a 37 ° C sob uma atmosfera de gás médico. Nota: O período de cultura &#39;bloco milrinona&#39; é necessário para alvo eficiente esgotamento mRNA / proteína. </li></ol> 4. Oocyte Cultura para maturação meiótica <ol><li> Dia 4: Para cada grupo experimental de oócitos set-up 4 pratos de cultura (35 mm) com 3 ml de MEM / BSA. Suplemento um prato meios por grupo com 10% (alta qualidade) de soro fetal de bovino (FBS) a ser usado para a maturação do oócito. Permitir que todos os pratos de cultura para equilibrar a 37 ° C com mistura de gases medicinais. </li><li> Para libertar a partir de oócitos &#39;bloco milrinona&#39;, sequencialmente lavar os oócitos três vezes em placas contendo MEM / BSA e depois transferir os oócitos para o prato de maturação contendo meio com FBS a 10%. Todos os grupos de cultura de oócitos durante 17 horas a 37 ° C, para permitir a retomada e progressão da meiose. </li><li> Dia 5: Preparar soluções para FIXA oócitoção, incluindo: (i) 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão PEM (100 mM PIPES [pH 6,9], MgCl 2 1 mM, EGTA 1 mM) com 0,5% de Triton-X 100, e (ii) de PBS suplementado com 5 % de FBS que vai ser usada para lavar e bloquear os oócitos. Nota: Estas soluções requerem pré-aquecimento a 37 ° C, antes da fixação do oócito. </li><li> Para a fixação do oócito (após a cultura de 17 horas), rapidamente transferir cada grupo experimental de oócitos por pipetagem boca ou métodos alternativos em poços individuais (de um 4-bem prato) contendo 750 ul de pré-aquecido solução PFA a 4% e incubar a 37 ° C durante 1 h. Subsequentemente lavar cada grupo de oócitos de 3 vezes (15 minutos cada) em 750 ul de PBS pré-aquecido contendo 5% de FBS. </li><li> Oócitos de bloco em 200 ul de PBS / FBS a 5% O / N a 4 ° C para minimizar a ligação não específica de anticorpos. </li></ol> 5. Análise de imunofluorescência <ol><li> DIA 6: Nota: A imunocoloração é feito de uma placa multi-poços e o OOCytes são serialmente transferidos para poços sequenciais, contendo as respectivas soluções de anticorpos e de lavagem. 48 ou placas de 96 poços pode ser usado, basta ajustar o volume da solução com base no tamanho bem. Para placas de 96 poços utilizar 200 ul por poço. Os oócitos são transferidos para as diferentes soluções pela seguinte ordem: solução de anticorpo primário - 3 - da solução de lavagem de poços anticorpo secundário - 3 poços de lavagem. Para limitar a exposição à luz a placa pode ser coberto com a folha. Preparar uma solução de PBS / 5% de FBS e usar esta solução para preparar as diluições de anticorpos (por exemplo, de coelho anti-pericentrin (1 / 1.000), de ratinho anti-tubulina (1 / 1.000)). </li><li> Transferir os oócitos fixos de cada grupo experimental para poços individuais contendo 200 uL (ou 100 uL, se é desejada menos volume) da solução de anticorpo primário e cobrir o poço com parafilme. Incubar de acordo com as condições específicas do anticorpo óptimas (por exemplo, 37 ° C durante 1 hora, ou 4 ° CO / N). Nota: O anticorpo primário dilution, bem como o tempo de incubação específico e temperatura exigem testes para determinar as condições ideais para diferentes anticorpos utilizados. </li><li> Após a incubação com o anticorpo primário, os oócitos lavar três vezes em PBS / FBS a 5% (10-15 min cada). </li><li> Transferir os oócitos na solução contendo anticorpos secundários conjugados com fluorescência (por exemplo, 1 / 1.000 a diluição dos anticorpos anti-coelho e anti-murganho conjugados com fluorocromos de diferentes comprimentos de onda). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar os oócitos três vezes em PBS / FBS a 5% (10 - 15 min cada). </li><li> Após o passo final de lavagem, transferir os oócitos em uma lâmina de vidro limpa e delicadamente aspirar qualquer solução de lavagem em excesso. Isto vai imobilizar os oócitos na superfície do vidro. Adicionar 8 mL de mídia (contendo DAPI) de montagem e sobrepor cuidadosamente a mídia de montagem com uma 22 mm x 22 milímetros lamela. Abaixe a lamela lentamente para evitar bolhas de interceptação e / ou danificar os ovócitos. Nota: Alternativamente, para manter as propriedades de 3-dimensionais do oócito para análise de microscopia confocal, adicionar um pequeno volume de esferas de vidro de 100 uM (misturado com geleia de petróleo) para os cantos da lâmina de cobertura antes da montagem sobre a lâmina. </li><li> Armazenar as lâminas a 4 ° C, ou prosseguir para a avaliação de progressão meiótica, bem como a análise dos níveis de expressão e localização subcelular da proteína utilizando um microscópio de fluorescência equipado com os filtros necessárias para coincidir com os anticorpos secundários utilizados. </li></ol>

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Embora existam vários métodos para a transferência de ácido nucleico exógeno em células somáticas, tais como a electroporação e a transfecção, microinjecção é o método ideal para a administração de moléculas de ARN em oócitos de rato transcricionalmente quiescentes. O protocolo atual fornece uma abordagem eficaz para in vitro esgotamento de mRNAs específicos que permitem que o teste funcional de diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos. Esta abordagem resulta em esgotame...

A meiose é um processo de divisão única que ocorre em gametas (óvulos e espermatozóides) e envolve duas divisões sucessivas sem intervir síntese de DNA para separar cromossomos homólogos e cromátides irmãs durante a meiose-I e meiose-II, respectivamente 1. Erros na segregação dos cromossomos durante a divisão da meiose em oócitos pode resultar em aneuploidia, que é herdado pelo embrião durante a fertilização. Notavelmente, a incidência de aneuploidia em embriões em desenvolvimento aumenta com o avançar da idade materna e é uma causa principal de defeitos congénitos congénitas, bem como a perda da gravidez em mulheres 1,2, assim, uma necessidade importante sublinhar a compreender a base molecular de aneuploidia durante a divisão meiótica . Durante a divisão celular, a segregação cromossômica depende fundamentalmente da montagem do aparelho do fuso microtúbulos e estabelecimento de interações cromossômicas-microtúbulos estáveis ​​para a correta fixação ao eixo opostopólos. É importante ressaltar que a formação do fuso meiótico em ovócitos de mamíferos difere da mitose em células somáticas, e é regulada por centros de organização de microtúbulos únicos (MTOCs) que não possuem centríolos 3,4. Proteínas essenciais necessárias para a nucleação de microtúbulos e organização para localizar MTOCs ovócitos, incluindo γ-tubulina que catalisa a montagem de microtúbulos. Além disso, pericentrin funciona como uma proteína essencial andaime, que se liga e âncoras y-tubulina, bem como de outros factores na MTOCs 5. Notavelmente, os nossos estudos mostram que a depleção de proteínas principais associadas interrompe-MTOC organização fuso meiótico e conduz a erros de segregação cromossoma em oócitos, que não são inteiramente resolvidas pelo posto de montagem do eixo (SAC) 6,7. Portanto, defeitos de estabilidade do fuso, que não provocam detenção meiótica, representam um risco significativo na contribuição para a aneuploidia. Apesar de seu papel essencial na montagem do fuso e organização, prot MTOC oócitocomposição e função ein permanece pouco compreendida. Testando a função de proteínas alvo específicas em oócitos de mamíferos é um desafio, como as células tornam-se transcricionalmente quiescente pouco antes do recomeço da meiose 8,9. Assim, os oócitos pré-ovulatórios dependem lojas de ARNm maternais para retomar a meiose e a apoiar divisão meiótica, bem como as primeiras divisões de clivagem após a fertilização 10,11. A eficácia de interferência de RNA (RNAi) degradação mediada de transcritos de mRNA em oócitos de mamíferos está bem estabelecida e RNAs maternas recrutados para a tradução durante a maturação meiótica são particularmente passível de siRNA alvejando 12-14. Portanto, a microinjecção de RNAs interferentes curtas (siARN) em oócitos fornece uma ferramenta valiosa para esgotar mRNAs alvo para testes funcionais. Aqui, descrevemos métodos para o isolamento de oócitos de camundongos e esgotamento mediado por siRNA de transcri específicopts para testar a função de uma proteína essencial MTOC-associado, pericentrin. Além disso, descreve-se as condições de análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótica em oócitos.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

A microinjecção de siRNAs proporciona uma abordagem eficaz para a degradação de ARNm e proteína subsequente depleção em oócitos, que permite o teste funcional eficiente e altamente específico de diferentes factores alvo in vitro. Subsequentemente, a imunofluorescência é utilizado para a análise de fenótipo específico, bem como para validar a depleção de proteínas em oócitos injectados com siRNA. No exemplo atual, marcação fluorescente de oócitos individuais com DAPI em conjunto com anticorp...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.

Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K visualizações.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos. 

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Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transferência nuclear em oócitos de camundongos

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biologia

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Recuperação de oócitos de camundongos

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

Recolha e criopreservação de óvulos e embriões de camundongos Hamster

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em<em&gt; Drosophila</em&gt; Oócitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...