This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Universität von Georgia genehmigt. 1. Vorbereitungen <ol><li> Für Eizelle Kultur, Kauf oder frisch vorbereiten Minimal Essential Medium (MEM) und ergänzt mit 3 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA), wie in Tabelle 1 dargestellt. Legen Sie eine Polystyrol-Flasche auf einer Ladebilanz (Tara auf Null). Fügen Sie alle Reagenzien außer BSA, um und rufen Sie das Endvolumen mit MQ-Wasser-Gewichts auf insgesamt 250 g. Dann fügen Sie die BSA, zu ermöglichen, sich aufzulösen und Filter zu sterilisieren. Anmerkung: Die beschriebene MEM Medium verlangt Äquilibrierung und Zell Inkubation mit einem medizinischen Gasgemisch aus 5% CO 2, 5% O 2 und 90% N 2. Jedoch können auch andere Medien (zB CZB) verwendet werden, die für die Zell Inkubation in 5% CO 2 unter Atmosphärenbedingungen zu ermöglichen. </li><li> Für Eizelle Mikroinjektion, Kauf oder zur Vorbereitung M2 Medium. </li><li> Bereiten pregnant Stutenserum-Gonadotropin (PMSG) auf eine Konzentration von 5 IU / 100 ul. </li><li> Kauf und wiederherzustellen siRNA Aktien auf eine Arbeitskonzentration von 1 uM. </li></ol> 2. Maus Eizellenentnahme <ol><li> TAG 1: Zur Stimulierung Ovarialfollikel Entwicklung und Erhöhung der Zahl der präovulatorischen Follikel, verwalten 5 IU PMSG intraperitoneal weiblichen Mäusen 48 Stunden vor der Eizellenentnahme. </li><li> TAG 3: Für die Eizellenentnahme und Kultur, bis 35 mm Kulturschalen Set mit 3 ml MEM / BSA mit 1 ug / ml Milrinon ergänzt. Diese Phosphodiesterase-Hemmer unterhält die Eizellen in der Prophase-I festzunehmen und verhindert Keimbläschen Aufteilung (GVBD). Gleichgewicht kommen die Kulturschalen in einem medizinischen Gasgemisch für mindestens 15 min. Hinweis: in ganz Eizellenentnahme sowie Eizelle Mikroinjektion und der 24-Stunden-Kultur Halteperiode Beitrag siRNA wird Milrinone ergänzt Medien erforderlich. </li><li> Abrufen Eierstöcke von den weiblichen Mäusen mit etablierten Laborpraxis 15 und Transfer zu einem neuen Kulturschale mit vorgewärmtem und ins Gleichgewicht gebracht MEM / BSA / Milrinon. </li><li> Legen Sie die Kulturschale auf der Bühne eines Stereomikroskops für die Eizellenentnahme. Release Kumulus-Eizell-Komplexe (COCs) durch manuelles Punktieren der Antralfollikeln mit 27 G Nadeln. Befestigen einem Eierstock, um den Boden der Kulturschale mit einer 27 G-Nadel in eine 1 ml-Spritze angebracht ist, und mit einem zweiten Nadel um alle großen Follikeln stechen. Wiederholen Sie für jede Eierstock. </li><li> Unter Verwendung von Standardverfahren Pipettieren mit dem Mund oder andere Mittel der Oozytenaspiration, sammeln Sie alle Eizellen, die von 2 oder mehr Schichten von kompakten Cumuluszellen umgeben sind. Übertragen Sie die COC auf ein neues Gericht und bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Die umgebenden Cumuluszellen durch wiederholte vorsichtiges Pipettieren Entfernen Sie vorsichtig mit einer 1 ml Pipette auf eine Aspiration Volumen von 750 &amp; mgr; l eingestellt. Wiederholen Sie den Pipettierschritt etwa 12-malund ermöglichen die Oocyten für 5 min wiederherzustellen. Fahren Sie auf diese Weise fort, bis alle oder die meisten der Cumuluszellen entfernt wurden. Übertragen Sie die entblößt Eizellen zu einem anderen Kulturschale und lassen Sie sie bei 37 ° C für 15 Minuten ins Gleichgewicht kommen. </li><li> (I) Mikroinjektion von spezifischen siRNAs gegen das Ziel von Interesse, (ii) Mikroinjektion von unspezifischen (Kontrolle) siRNAs und (iii) ein nicht-injizierten Kontrollgruppe zur Rechenschaft: Zuweisung der denudierten Oozyten in drei experimentellen Gruppen zu verwenden für Kulturbedingungen. </li></ol> 3. Oocyte Mikroinjektion <ol><li> Up-Kulturschalen mit 3 ml M2-Medium mit Milrinon (1 ug / ml) ergänzt zur Eizelle Mikroinjektion gesetzt. Bereiten Kulturschalen mit MEM / BSA / Milrinon zum Waschen und nachfolgende Kultur der injizierten Oozyten. Anmerkung: M2 Medium HEPES-Puffer und erfordert Vorwärmen auf 37 ° C für 15 Minuten unter atmosphärischen Bedingungen. MEM erfordert Vorwärmen und Gleichgewichtseinstellung mit medizinischen Gasen, wie beschreiben,d oben. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektionssystem. Laden die Injektionsnadel mit 5 ul von 1 uM spezifische siRNA Lösung. Sichern Sie die Haltepipette und Injektionsnadel, um Mikromanipulatoren der Mikroinjektionssystem und die Einspritzeinheit mit kalibrierten Volumen und Druck gesetzt. </li><li> Legen Sie eine 200 &amp; mgr; Mikro-Tropfen M2 Medien auf der Innenseite des Deckels einer 3 cm Kulturschale und füge eine Eizelle für die Einrichtung und die Ausrichtung der Mikroinjektionssystem. </li><li> Unter Verwendung der Eizelle als Leitfaden, passen Sie die Positionen der Halte- und Injektionsnadeln. Übernehmen Unterdruck auf den Haltepipette vorsichtig sichern die Eizelle und die Position der Injektionsnadel mit dem breitesten Durchmesser der Zelle. Passen Sie die Einstellungen, um die Mikroinjektion von ca. 10 pl der siRNA-Lösung überall in die Eizelle Zytoplasma ermöglichen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> Abbildung 1. Oocyte Mikroinjektion einzurichten. ( <strong&gt; A) repräsentative Bild eines 200 ul Mikrotropfen M2-Medium auf dem Deckel aus einer 3 cm Kulturschale angeordnet, wobei die Haltepipette und Injektionsnadel auf der linken bzw. rechten Seite angeordnet ist. (B) Prophase Gruppe-I festgenommen Oozyten (GV-Stufe) vor der Mikroinjektion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </li><li> Bringen Sie den Deckel mit dem Stereomikroskop Bühne und fügen Sie eine 200 &amp; mgr; Mikro-Tropfen Frisch M2 Medien. Hinzufügen einer Gruppe von Oozyten (~ 10), um die Mikro-Tropfen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Verfahren, dann den Deckel mit Mikro-Tropfen in die Mikroinjektion der Bühne. <ol><li> Gehen Sie die einzelnen Eizellen microinject. Sichern einer Eizelle mit der Haltepipette langsam führen Sie die Spitze der Injektionsnadel in das Zytoplasma und vertreiben das Injektionsvolumen von siRNA-Lösung. Der Injektionsnadel und mo sorgfältig zurückzuziehenve des injizierten Oozyten zu einer Position am Boden des Mikrotropfen. Bewegen erfolglos injizierten Oozyten zu einer Position an der Spitze der Mikrotropfen. </li><li> Wiederholen Sie den Mikroinjektionsverfahren mit jeder Eizelle. Um optimale Oozyte Lebensfähigkeit microinject nur eine kleine Anzahl von Oozyten zu einem Zeitpunkt zu erhalten. Dafür sorgen, dass dieser Vorgang nicht länger als ein paar Minuten auf die Temperatur und den pH-Wert in der Mikrotropfen zu verhindern. </li></ol></li><li> Saugen Sie Oozyten erfolgreich injiziert oder vorsichtig bewegen Sie den Deckel mit der Mikro-Tropfen injizierten Oozyten mit dem Stereomikroskop. Übertragen Sie die injiziert lebensfähigen Eizellen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Methoden, um / BSA / Milrinon Medium zu waschen und ins Gleichgewicht bei 37 ° C MEM. </li><li> Mit einem weiteren Gruppe von Oozyten, wiederholen Sie den Mikroinjektionsverfahren mit einer neuen Injektionsnadel mit unspezifischen siRNAs für die Kontrollgruppe geladen. In eine separate Kulturschale Waschen Sie die Oozyten in MEM / BSA / Milrinon und Transfer. </li><li> Kultur Alle GruppenOocyten für 24 h in MEM / BSA / Milrinon bei 37 ° C unter einer Atmosphäre eines medizinischen Gases. Hinweis: Die &#39;Milrinon Block&#39; Kulturzeit wird zur effizienten Ziel mRNA / Protein-Abbau benötigt wird. </li></ol> 4. Oocyte Kultur für Meiotische Reifung <ol><li> TAG 4: Für jede Versuchsgruppe von Eizellen Aufbau 4 Kulturschalen (35 mm) mit 3 ml MEM / BSA. Ergänzen Medien Teller pro Gruppe mit 10% (hochwertigen) fötalem Rinderserum (FBS), die für die Eizellreifung zu verwenden. Lassen Sie alle Kulturschalen bei 37 ° C mit medizinischen Gasgemisch ins Gleichgewicht. </li><li> Eizellen von &#39;Milrinon Block&#39; freigeben, der Reihe nach zu waschen die Oozyten dreimal in Schalen mit MEM / BSA und übertragen dann die Eizellen in die Reifungsschale, die Medien mit 10% FBS. Kultur Alle Oocyten Gruppen für 17 h bei 37 ° C, um die Wiederaufnahme der Meiose und der Progression zu ermöglichen. </li><li> TAG 5: Bereiten Sie Lösungen für Eizelle fixation, einschließlich: (i) 4% Paraformaldehyd (PFA) in PEM-Puffer (100 mM PIPES [pH 6,9], 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA) mit 0,5% Triton-X-100 und (ii) PBS, supplementiert mit 5 % FBS, die verwendet werden, um zu waschen und blockieren die Oozyten werden. Anmerkung: Diese Lösungen erfordern Vorwärmen auf 37 ° C vor der Oozyte Fixierung. </li><li> Für Eizelle Fixierung (nach dem 17 Stunden-Kultur), zügig jeder Versuchsgruppe von Eizellen übertragen durch Pipettieren mit dem Mund oder alternative Methoden in einzelnen Wells (eines 4-Well-Platte), die 750 ul vorgewärmtes 4% PFA-Lösung und bei 37 ° C für 1 Stunde. Anschließend jede Gruppe von Oozyten in 750 ul vorgewärmtes PBS, das 5% FBS 3x waschen (jeweils 15 min). </li><li> Block Oocyten in 200 ul PBS / 5% FBS O / N bei 4 ° C unspezifische Antikörper zu minimieren bindend. </li></ol> 5. Immunfluoreszenzanalyse <ol><li> TAG 6: Anmerkung: Die Immunfärbung in einer Multi-Well-Platte und dem OOC getanytes seriell sequenzielle Vertiefungen übertragen, die entsprechende Antikörper und Waschlösungen. Entweder 48 oder 96-Well-Platten verwendet werden kann, passen Sie einfach das Lösungsvolumen auf der Grundlage gut Größe. Für 96-well Platten verwenden 200 ul pro Vertiefung. - 3 Waschbrunnen - sekundäre Antikörperlösung - 3 Waschbrunnen primären Antikörperlösung: Die Eizellen werden auf die verschiedenen Lösungen in der folgenden Reihenfolge verteilt. Zur Belichtung kann die Platte mit Folie abgedeckt werden, zu begrenzen. Bereiten Sie frische PBS / 5% FBS und die Nutzung dieser Lösung für Antikörperverdünnungen vorbereiten (zB Kaninchen-Anti-Pericentrin (1 / 1.000), Maus-Anti-Tubulin (1 / 1.000)). </li><li> Transfer der festen Oozyten jeder Versuchsgruppe in einzelne Vertiefungen, die 200 &amp; mgr; l (oder 100 &amp; mgr; l, wenn weniger Volumen gewünscht wird) der primären Antikörperlösung und der Abdeckung der Vertiefung mit Parafilm. Inkubieren nach optimalen antikörperspezifische Bedingungen (zB 37 ° C für 1 h, oder bei 4 ° CO / N). Hinweis: Primärer Antikörper dilution sowie spezifische Inkubationszeit und -temperatur erfordern Tests, um die optimalen Bedingungen für verschiedene Antikörper verwendet, zu bestimmen. </li><li> Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper, wasche die Oocyten dreimal in PBS / 5% FBS (jeweils 10-15 Minuten). </li><li> Übertragung der Oozyten in der Lösung, die fluoreszierend konjugierten Sekundärantikörper (zum Beispiel 1 / 1.000-Verdünnung von Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper mit Fluorochromen unterschiedlicher Wellenlänge konjugiert). Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> (- 15 Minuten je 10) dreimal in PBS / 5% FBS Waschen der Oozyten. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt, übertragen Sie die Oozyten auf einen sauberen Glasobjektträger und sanft saugen überschüssige Waschlösung. Dadurch werden die Oozyten auf der Glasoberfläche zu immobilisieren. In 8 ul Eindeckmittel (mit DAPI) und sorgfältig überlagern die Montage Medien mit einem 22 mm x 22 mm Deckglas. Senken Sie die Deck langsam zu vermeiden, Luftblasen und / oder Beschädigung der Oozyten. Hinweis: Alternativ zu den 3-dimensionalen Eigenschaften von der Eizelle für die konfokale Mikroskopie-Analyse zu erhalten, fügen ein kleines Volumen von 100 &amp; mgr; m Glasperlen (gemischt mit Vaseline) zu den Ecken des Deckglases vor der Befestigung auf der Folie. </li><li> Objektträger bei 4 ° C oder für die Beurteilung der meiotischen Progression sowie die Analyse der Expressionsspiegel und subzelluläre Lokalisierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den notwendigen Filtern ausgerüstet, um die sekundären Antikörper verwendet übereinstimmen fortzufahren. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

Zwar gibt es verschiedene Methoden zur exogene Nukleinsäure-Transfer in somatischen Zellen, wie Elektroporation und Transfektion die Mikroinjektion ist die beste Methode für die Lieferung von RNA-Molekülen in transkriptionell ruhenden Maus-Oozyten. Das aktuelle Protokoll stellt einen effektiven Ansatz für in vitro-Abreicherung von spezifischen mRNAs, die die Funktionstests der verschiedenen Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oozyten zu aktivieren. Dieser Ansatz führt zu einer effizienten Tran...

Die Meiose ist eine einzigartige Teilungsprozess, die in Keimzellen (Eizellen und Spermien) tritt auf, und umfasst zwei aufeinanderfolgende Divisionen ohne dazwischen DNA-Synthese auf homologen Chromosomen und Schwesterchromatiden während der Meiose-I und Meiose-II, die jeweils 1 zu trennen. Fehler in der Chromosomensegregation während der Meiose in Oocyten können in Aneuploidie, die durch den Embryo während der Befruchtung vererbt wird zur Folge haben. Bemerkenswert ist, das Auftreten von Aneuploidie in sich entwickelnden Embryonen erhöht mit zunehmendem Alter der Mutter und ist eine Hauptursache von angeborenen Missbildungen sowie Verlust der Schwangerschaft bei Frauen 1,2, so unterstreicht eine wichtige Notwendigkeit, die molekularen Grundlagen der Aneuploidie im Reifeteilung zu verstehen, . Während der Zellteilung ist Chromosomensegregation entscheidend von der Montage des Mikrotubuli-Spindelapparat und Etablierung von stabilen Chromosomen-Mikrotubuli-Interaktionen auf korrekte Befestigung zu GegenspindelPole. Wichtiger ist, meiotischen Spindelbildung in Säuger Oozyten unterscheidet sich von Mitose in somatischen Zellen und durch einzigartige Mikrotubuli-Organisationszentren (MTOCs) die centrioles 3,4 fehlt geregelt. Essentiellen Proteine ​​für Mikrotubulusbildung und Organisation notwendig zu lokalisieren, um Eizelle MTOCs, einschließlich γ-Tubulin, die Mikrotubuli Montage katalysiert. Zusätzlich Pericentrin Funktionen als wesentlichen Gerüstprotein, das bindet und Dübel γ-Tubulin, sowie andere Faktoren MTOCs 5. Insbesondere zeigen unsere Studien, daß Abreicherung Schlüssel MTOC-assoziierten Proteine ​​stört meiotischen Spindel Organisation und führt zu Fehlern in der Chromosomensegregation Oozyten, die nicht vollständig durch die Spindelanordnung checkpoint (SAC) 6,7 gelöst sind. Daher Fehlern Spindel Stabilität, die Meiosehemmung nicht auslösen, ein erhebliches Risiko als Beitrag zu Aneuploidie. Trotz ihrer wesentliche Rolle bei der Spindelanordnung und Organisation, Eizelle MTOC protEin Zusammensetzung und Funktion bleibt kaum verstanden. Testen der Funktion spezifischer Zielproteine ​​in Säugetier Oozyten ist eine Herausforderung, da die Zellen transkriptionell Ruhe kurz vor der Wiederaufnahme der Meiose 8,9. Daher verlassen sich präovulatorischen Oozyten auf mütterliche mRNA speichert, um die Meiose wieder aufzunehmen und zu unterstützen Reifeteilung sowie die ersten Furchungsteilungen nach der Befruchtung 10,11. Die Wirksamkeit der RNA-Interferenz (RNAi) vermittelten Abbau der mRNA-Transkripte in Säuger Oozyten ist gut etabliert und Mütter RNAs für die Übersetzung während der meiotischen Reifung rekrutiert werden, um siRNA Targeting 12-14 besonders zugänglich. Daher stellt die Mikroinjektion von short interfering RNAs (siRNAs) in Oozyten einen wertvollen Ansatz für die Ziel-mRNAs für die Funktionsprüfung führen. Hier werden Verfahren zur Isolierung von Maus-Oozyten und siRNA-vermittelte Abreicherung von spezifischen transcri beschreiben wirPunkte, die Funktion eines wesentlichen MTOC-assoziiertes Protein zu testen, Pericentrin. Darüber hinaus beschreiben wir Immunofluoreszenzanalyse Bedingungen meiotischen Spindelbildung in Oozyten zu bewerten.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pregnant Mare&#039;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM)</td><td></td><td></td><td>*Recipe outlined in Table 1</td></tr><tr><td>Earle&#039;s Balanced Salt Solution (10x)</td><td>Sigma</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, sodium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G, potassium salt&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, disodium salt dihydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>Essential Amino Acids (50x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red solution</td><td>Sigma</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs targeting Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>Negative control siRNAs&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent Microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet Micro-injections System</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro manipulators</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-injection needles (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>Holding pipettes (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasticware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm CA Filter System</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430768</td><td></td></tr></tbody></table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Mikroinjektion von siRNAs bietet einen effektiven Ansatz für die mRNA-Abbau und die anschließende Proteinabbau in Oozyten, die effiziente und hochspezifische Funktionsprüfung von unterschiedlichen Zielfaktoren in vitro ermöglicht. Anschließend wird Immunofluoreszenz für spezifische Phänotyp-Analyse verwendet sowie zur Proteinabbau in siRNA-injizierten Oozyten validieren. In dem aktuellen Beispiel Fluoreszenzmarkierung von einzelnen Oozyten, die mit DAPI zusammen mit Anti-Tubulin und Anti Pericentrin Anti...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

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11.6K Aufrufe.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten. 

Serie: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Chromatin Spread Preparations for the Analysis of Mouse Oocyte Progression from Prophase to Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for spermatogenesis. These techniques allow for visualization of protein and DNA localization patterns during meiotic events such as homologous chromosome pairing, synapsis and DNA repair. While a few protocols have been described in the literature, general chromatin spread techniques using mammalian prophase oocytes are limited and difficult due to the timing of meiosis initiation in fetal ovaries. In comparison, prophase spermatocytes can be collected from juvenile male mice with higher yields without the need for microdissection. However, it is difficult to obtain a pure synchronized population of cells at specific stages due to the heterogeneity of meiotic and post-meiotic germ cell populations in the juvenile and adult testis. For later stages of meiosis, it is advantageous to assess oocytes undergoing meiosis I (MI) or meiosis II (MII), because groups of mature oocytes can be collected from adult female mice and stimulated to resume meiosis in culture. Here, methods for meiotic chromatin spread preparations using oocytes dissected from fetal, neonatal and adult ovaries are described with accompanying video demonstrations. Chromosome missegregation events in mammalian oocytes are frequent, particularly during MI. These techniques can be used to assess and characterize the effects of different mutations or environmental exposures during various stages of oogenesis. As there are distinct differences between oogenesis and spermatogenesis, the techniques described within are invaluable to increase our understanding of mammalian oogenesis and the sexually dimorphic features of chromosome and protein dynamics during meiosis.

Oogenesis in mammals is known to be error-prone, particularly due to chromosome missegregation. This manuscript describes chromatin spread preparation methods for mouse prophase, metaphase I and II-staged oocytes. These fundamental techniques allow for the study of chromatin-bound proteins and chromosome morphology throughout mammalian oogenesis.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Chromatin spread techniques have been widely used to assess the dynamic localization of various proteins during gametogenesis, particularly for ...

Forschung

Genetik

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively correlated with maternal age, age alone is not always predictive of the risk of generating an aneuploid embryo. Therefore, gene variants might account for incorrect chromosome segregation during oogenesis. Given that access to human oocytes is limited for research purposes, a series of assays were developed to study human gene function during meiosis I using mouse oocytes. First, messenger RNA (mRNA) of the gene and gene variant of interest are microinjected into prophase I-arrested mouse oocytes. After allowing time for expression, oocytes are synchronously released into meiotic maturation to complete meiosis I. By tagging the mRNA with a sequence of a fluorescent reporter, such as green fluorescent protein (Gfp), the localization of the human protein can be assessed in addition to the phenotypic alterations. For example, gain or loss of function can be investigated by establishing experimental conditions that challenge the gene product to fix meiotic errors. Although this system is advantageous in investigating human protein function during oogenesis, adequate interpretation of results should be undertaken given that protein expression is not at endogenous levels and, unless controlled for (i.e. knocked out or down), murine homologs are also present in the system.

As the genetic variants associated with human disease begin to become uncovered, it is becoming increasingly important to develop systems with which to rapidly evaluate the biological significance of those identified variants. This protocol describes methods for evaluating human gene function during female meiosis I using mouse oocytes.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the egg&#39;s developmental competence. Presence of the first polar body (PB) together with the meiotic spindle indicates completion of the oocyte maturation and the egg&#39;s readiness for fertilization. In clinical practice, it is customary to assume that all oocytes displaying a PB are mature metaphase (MII) oocytes. However, PB extrusion precedes the formation of the bipolar MII spindle. This asynchrony makes the mere presence of PB an unreliable marker of oocyte maturity. Noninvasive spindle imaging using polarized light microscopy (PLM) allows quick and easy inspection of whether the PB-displaying oocyte actually reassembled a meiotic spindle prior to ICSI. Here, we present a standard protocol to perform human egg maturity assessment in the clinical laboratory. We also show how to optimize the time of ICSI with respect to the oocyte&#39;s developmental stage in order to prevent premature sperm injection of late-maturing oocytes. Using this approach, even immature oocytes extruding PB in vitro can be clinically utilized. Affirmation that MII spindle is present prior to sperm injection and individual adjustment of the time of ICSI is particularly important in poor prognosis in-vitro fertilization (IVF) cycles with a low number of oocytes available for fertilization.

We provide an outline of the clinical protocol for non-invasive assessment of human egg maturity using polarized light microscopy.

Human Egg Maturity Assessment und seine klinische Anwendung

The optimal timing of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is of a serious concern for fertility programs because untimely sperm entry diminishes the ...

Entwicklungsbiologie

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at prophase I of the first meiotic division. After puberty and upon meiotic resumption, the nuclear membrane disassembles (nuclear envelope breakdown), and the spindle is assembled mainly at the oocyte center. Initial central spindle positioning is essential to protect against abnormal kinetochore-microtubule (MT) attachments and aneuploidy. The centrally positioned spindle migrates in a time-sensitive manner toward the cortex, and this is a necessary process to extrude a tiny polar body. In mitotic cells, spindle positioning relies on the interaction between centrosome-mediated astral MTs and the cell cortex. On the contrary, mouse oocytes lack classic centrosomes and, instead, contain numerous acentriolar MT organizing centers (MTOCs). At the metaphase I stage, mouse oocytes have two different sets of MTOCs: (1) MTOCs that are clustered and sorted to assemble spindle poles (polar MTOCs), and (2) metaphase cytoplasmic MTOCs (mcMTOCs) that remain in the cytoplasm and do not contribute directly to spindle formation but play a crucial role in regulating spindle positioning and timely spindle migration. Here, a multi-photon laser ablation method is described to selectively deplete endogenously labeled mcMTOCs in oocytes collected from Cep192-eGfp reporter mice. This method contributes to the understanding of the molecular mechanisms underlying spindle positioning and migration in mammalian oocytes.

An optimized protocol is presented that enables the depletion of cytoplasmic microtubule organizing centers in mouse oocytes during metaphase I using a near-infrared femtosecond laser.

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

The fidelity of oocyte meiosis is critical for generating developmentally competent euploid eggs. In mammals, the oocyte undergoes a lengthy arrest at ...

Identifizierung von DNA-Schäden in prophase-arrestierten Eizellen von Mäusen

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Autor im Rampenlicht: Verständnis der DNA-Schadensreaktion in Säugetier-Eizellen und Präimplantationsembryonen 

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Zusammenfassung

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Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Human Egg Maturity Assessment und seine klinische Anwendung

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung