This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

이 프로토콜은 조지아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 1. 준비 <ol><li> 갓 난자 문화, 구매 또는를 들어 최소 필수 중간 (MEM)를 준비하고 표 1에 설명 된대로 3 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)과 보완. (제로 용기)로드 밸런스에 폴리스티렌 병을 놓습니다. 위해, BSA를 제외한 모든 시약을 추가하고 250g의 총 중량 MQ-물에 최종 볼륨을 가지고. 그런 다음, BSA를 추가 용해 및 필터 소독 할 수 있습니다. 주 : 설명 MEM 배지, 5 % CO 2, 5 % O 2, N 2 90 %의 의료 ​​가스 혼합물로 평형화 세포 배양을 필요로한다. 그러나, 다른 미디어 (예 CZB)은 대기압 조건에서 5 % CO 2에서 세포 배양을 허용하는 사용될 수있다. </li><li> 난자의 미세 주입의 경우, 구매 또는 M2 매체를 준비합니다. </li><li> P 준비5 IU / 100 μL의 농도로 우세한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬 (PMSG). </li><li> 구입 및 1 μM의 작업 농도의 siRNA 주식을 재구성. </li></ol> 2. 마우스 난자 컬렉션 <ol><li> 1 일 : 난소의 난포 발달을 자극하고 배란 전 난포의 수를 증가, 복강 난자 컬렉션에 48 시간 이전에 여성 생쥐에 PMSG 5 IU를 관리 할 수 있습니다. </li><li> 주 3 : 난자 수집 및 문화에 대한 1 μg의 / ㎖ 밀리 논 보충 MEM / BSA의 3 ㎖로 35mm 배양 접시를 설정합니다. 이 포스 포 디에스 억제제의 난자를 유지 의향 - 내가 체포 새싹 소포 고장 (GVBD)을 방지 할 수 있습니다. 적어도 15 분 동안 의료 가스 혼합물에서 배양 접시 평형. 참고 : 밀리 논 보충 미디어는 난자 수집뿐만 아니라 난자의 미세 주입하고 24 시간 배양 유지 기간 이후의 siRNA에 걸쳐 필요합니다. </li><li> (15)을 실천 설립 실험실을 사용하여 암컷 마우스에서 난소를 검색하고 미리 예열과 함께 새로운 배양 접시에 전송하고 MEM / BSA / 밀리 논을 평형. </li><li> 난자 수집을위한 실체 현미경의 무대에서 배양 접시를 놓습니다. 릴리스 운 - 난자 - 단지 (COC의) 수동으로 27 G 바늘 난포을 천공하여. 1 ML의 주사기에 부착 된 27 G 바늘, 배양 접시의 바닥에 하나의 난소를 수정하고, 모든 큰 모공에 구멍을하는 두 번째 바늘을 사용합니다. 각각의 난소에 대해 반복합니다. </li><li> 소형 적운 세포의 2 층 이상에 둘러싸여 모든 난자를 수집, 표준 입 피펫 절차 나 난자 흡인의 다른 수단을 사용하여. 새로운 요리에 COC의 이동과 1 시간 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 조심스럽게 750 μL의 열망 볼륨 설정 1 ML의 피펫을 반복 부드러운 피펫 팅에 의해 주변 적운 세포를 제거합니다. 피펫 팅 단계를 약 12​​ 회 반복와 난자가 5 분 동안 복구 할 수 있습니다. 전부 또는 난구 세포의 대부분이 제거 될 때까지 이러한 방식으로 계속합니다. 다른 배양 접시에 무 결함 난자를 전송하고 15 분 동안 37 ℃에서 평형을 허용한다. </li><li> 를 고려하여 관심의 대상에 대해 특정 된 siRNA의 (ⅰ) 마이크로 인젝션, 불특정 (제어) 된 siRNA의 (ⅱ) 마이크로 인젝션, 및 (iii) 비 - 주입 된 대조군 : 세 개의 실험 그룹으로 무 결함 난자를 할당을 위해 사용될 배양 조건. </li></ol> 3. 난자 미세 주입 <ol><li> 난자에 미세 주입을위한 밀리 논 (1 μg의 / ml)로 보충 3 ㎖ M2 매체와 문화 요리를 설정합니다. 세척 및 주입 된 난자의 후속 문화 MEM / BSA / 밀리 논을 포함하는 배양 접시를 준비합니다. 주 : M2 배지 HEPES 완충액 함유하고 대기 조건 하에서 15 분 동안 37 ℃에서 미리 가온 요구한다. MEM은 설명 의료 가스를 사용하여 사전 온난화와 평형을 필요로위 거라고. </li><li> 미세 주사 시스템을 준비합니다. 1 μm의 특정 siRNA의 솔루션의 5 μL와 주사 바늘을로드합니다. 미세 주사 시스템의 미세 조작기에 유지 피펫과 주사 바늘을 고정 및 교정 볼륨과 압력으로 주입 장치를 설정합니다. </li><li> 3cm 배양 접시의 뚜껑의 안쪽 M2 매체의 200 μL 마이크로 - 드롭을 배치하고 설정 및 마이크로 인젝션 시스템의 정렬에 난자를 추가한다. </li><li> 참조 난자를 이용, 유지 및 주사 바늘의 위치를​​ 조정한다. 부드럽게 난자를 확보하고 셀의 넓은 직경에 주사 바늘의 위치를​​ 조정하는지지 피펫에 부압을 적용한다. 아무 곳이나 난자 세포질로의 siRNA 솔루션의 약 10 PL의 미세 주입 할 수 있도록 설정을 조정합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> 그림 1. 난자의 미세 주입을 설정합니다. ( <stroNG&gt; 각각 좌우에 위치하는 홀딩 피펫 및 주사 바늘 3cm 배양 접시에서 뚜껑에 배치 M2 매체의 200 μL 마이크로 드롭의) 대표 화상. (B) 그룹의 의향 - 나는 미세 주입하기 전에 난자 (GV-단계)를 체포했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 실체 현미경 단계로 뚜껑을 돌려 신선한 M2 미디어의 200 μL 마이크로 드롭을 추가합니다. 입 피펫, 또는 다른 방법으로 마이크로 하락 난자의 그룹 (~ 10)를 추가 한 다음 미세 주입 단계에 마이크로 드롭으로 뚜껑을 돌려줍니다. <ol><li> 각각의 난자를 microinject로 이동합니다. 천천히 세포질 내로 주사 바늘의 선단을 삽입 한 채 피펫 난자 확보 및 siRNA를 용액의 주입량을 추방. 조심스럽게 주사 바늘과 미주리 철회미세 방울의 하단 위치까지 주입 된 난자를했습니다. 마이크로 드롭의 상단에 위치에 실패 주입 난자를 이동합니다. </li><li> 각각의 난자에 미세 주입의 절차를 반복합니다. 시간에 최적의 난자 생존, 난자 microinject 소수만을 유지한다. 이 과정은 마이크로 드롭 온도와 pH가 변화를 방지하기 위해 몇 분 이상하지 않도록하십시오. </li></ol></li><li> 대기음이 성공적으로 난자를 주입 또는주의 실체에 주입 된 난자의 마이크로 드롭 뚜껑을 이동합니다. 세척하고 37 ℃에서 평형 / BSA / 밀리 논 매체를 MEM하는, 입 피펫 또는 다른 방법에 의해 주입 가능한 난자를​​ 전송합니다. </li><li> 난자들의 또 다른 그룹을 사용하여, 대조군에 대한 비 특정 된 siRNA 로케이션 새로운 주사 바늘로 마이크로 인젝션 프로세스를 반복한다. 별도의 배양 접시에 MEM / BSA / 밀리 논 및 전송에 난자를 씻으십시오. </li><li> 문화 모든 그룹의료 가스의 분위기 하에서 37 ℃에서 MEM / BSA / 밀리 논에서 24 시간 동안 난자. 주 : &quot;밀리 논 블록 &#39;배양 기간이 효율적인 표적 mRNA의 / 단백질 고갈 필요하다. </li></ol> 감수 성숙 4. 난자 문화 <ol><li> 주 4 : 난자의 각 실험군의 경우 3 ㎖ MEM / BSA와 설정 (4) 배양 접시 (35mm). 난모 세포의 성숙에 사용하는 10 % (고화질) 소 태아 혈청 (FBS)과 그룹 당 하나의 미디어 접시 보완. 모든 문화 요리 의료 가스 혼합물을 37 ℃에서 평형을 허용합니다. </li><li> 순차적으로, &#39;밀리 논 블록&#39;에서 난자를 방출 MEM / BSA를 포함하는 요리 난자 세 번 세척 후 10 % FBS와 미디어를 포함하는 성숙 접시에 난자를 전송합니다. 문화 37 ° C에서 17 시간 동안 모든 난자 그룹은 재개과 감수 분열의 진행을 활성화합니다. </li><li> 하루 5 : 난자 fixa 준비 솔루션기, 포함 : (ⅰ) PEM 완충액에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (100 밀리미터 PIPES [pH를 6.9, 1 mM의의 MgCl 2, 1mM의 EGTA), 0.5 % 트리톤 X 100, 및 (ii) PBS 5 보충과 씻고 난 모세포를 차단하는 데 사용할 % FBS. 참고 :이 솔루션은 이전에 난자 고정 37 ° C의 온난화가 미리 필요합니다. </li><li> (17 시간 배양 후) 난자 고정의 경우, 신속하게 750 ㎕를 포함하는 입 피펫 또는 (4 잘 접시의) 개별 우물에 다른 방법으로 난자의 각 실험군을 전송할 4 % PFA 솔루션을 미리 예열 37 부화 1 시간 동안 C를 °. 그 후 5 % FBS를 포함하는 미리 예열 PBS 750 μL에 3 회 (15 분마다)을 난자의 각 그룹을 씻는다. </li><li> 4 ° C에서 200 μL PBS / 5 % FBS O / N에서 블록 난자가 결합 불특정 항체를 최소화합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 분석 <ol><li> 6 일 : 주 : 면역 염색은 멀티 웰 플레이트에서 수행된다 OOCytes 직렬 각각의 항체 및 세척 솔루션을 포함, 연속 우물로 전송됩니다. 어느 48 또는 96 웰 플레이트를 사용할 수 있고, 단순히 잘 크기에 따라 용액의 양을 조정한다. 96 웰 플레이트에 잘 당 200 μL를 사용합니다. - 3 웰 워시 - 이차 항체 용액 - 3 워시 웰 차 항체 용액 : 난자는 다음과 같은 순서로 다른 솔루션에 전송된다. 판 호일로 커버 할 수 빛 노출을 제한합니다. 신선한 PBS / 5 % FBS를 준비하고 항체 희석을 준비하기 위해이 솔루션을 사용 (예를 들어, 토끼 반 pericentrin (1 / 1,000), 마우스 항 - 튜 불린 (1 / 1,000)). </li><li> 차 항체 용액 (부피가 덜 요구된다면, 100 μL) 200 μl를 각각의 웰에 포함 된 각 실험군의 고정 된 난 모세포를 옮기고 잘 파라 필름으로 커버. 최적의 항체 특정 조건에 따라 품어 (예를 들어, 1 시간 또는 4 ° CO / N 37 ° C를). 참고 : 1 차 항체 dilutio을N뿐만 아니라 특정 배양 시간과 온도는 사용 된 다른 항체에 대한 최적의 조건을 결정하기 위해 테스트를 필요로한다. </li><li> 차 항체와 부화 후, PBS / 5 % FBS (10 ~ 15 분마다)에 난자를 세 번 씻는다. </li><li> 형광 접합 된 이차 항체를 포함하는 용액에 난자를 전송 (예를 들어, 서로 다른 파장의 형광 색소와 접합 된 항 - 토끼 항 마우스 항체의 1 / 1000 희석). 37 ℃에서 1 시간 동안 품어. </li><li> (- 15 분 각 10) PBS / 5 % FBS에서 난자 세 번 씻으십시오. </li><li> 최종 세척 단계 후, 깨끗한 유리 슬라이드에 난자를 전송하고 부드럽게 초과 세척 솔루션을 대기음. 이것은 유리 표면에 난자를 고정한다. 미디어 (DAPI를 포함)를 장착 8 μl를 추가 조심스럽게 22mm X 22mm 커버 슬립에 장착 매체를 오버레이. 난자를 공기 방울을 트래핑 및 / 또는 손상을 방지하기 위해 천천히 커버 슬립을 낮 춥니 다. 참고 : 또는, 공 초점 현미경 분석 난자의 3 dimentional 속성을 유지 종래 슬라이드 마운팅로 커버 슬립의 모서리에 100 μm의 유리 비드 (바셀린 혼합)의 작은 부피를 추가. </li><li> 4 ℃에서 보관 슬라이드 또는 감수 진행의 평가뿐만 아니라 사용 된 이차 항체에 맞게 필요한 필터가 장착 된 형광 현미경을 이용하여 발현 수준과 세포 내 단백질 위치 파악의 분석을 진행. </li></ol>

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	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. 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The authors have nothing to disclose

이러한 전기 천공과 같은 형질 체세포로 외인성 핵산 전달을위한 여러 가지 방법이 있지만, 마이크로 인젝션은 전사적으로 정지 된 난 모세포에 마우스 RNA 분자의 전달을위한 최적의 방법이다. 현재의 프로토콜은 서로 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 테스트를 가능하게 특정의 mRNA의 체외 고갈에 대한 효과적인 접근 방법을 제공합니다. 이러한 접근 방식은 효율적인 성...

감수 분열은 생식 세포 (난자와 정자)에서 발생하고 감수 분열-I 및 감수 분열-II, 각각 1시 상동 염색체와 자매 염색 분체를 분리하는 DNA 합성을 개입하지 않고 두 개의 연속 부문을 포함하는 고유의 분할 과정이다. 난자의 감수 분열시 염색체 분리의 오류 수정시 배아 상속 이수성,이 발생할 수 있습니다. 특히, 개발 배아의 염색체의 발생률은 산모의 나이 발전과 함께 증가하고 여성 1,2 임신 손실뿐만 아니라 선천성 기형아 출산의 주요 원인이며, 따라서, 감수 분열시 염색체의 분자 기초를 이해하는 중요한 필요성을 강조 . 세포 분열시 염색체 분리 반대 스핀들에 올바른 부착에 대한 미세 소관 스핀들 장치 및 안정적인 염색체 미세 소관의 상호 작용의 설립의 조립에 결정적으로 의존극. 중요한 것은, 포유 동물 난자의 감수 스핀들 형성은 체세포에서 유사 분열과 다른, 독특한 미세 소관 조직 센터 중심 소체 3,4 부족 (MTOCs)에 의해 조절된다. 미세 소관의 핵 및 조직에 필요한 필수 단백질은 미세 소관의 조립을 촉매 γ-tubulin에 포함 난자 MTOCs에 지역화. 또한,도 5에 결합 MTOCs 필수적인 비계 단백질로서 기능하고 앵커 γ-tubulin에뿐만 아니라 다른 요인 pericentrin. 특히, 우리의 연구는 키 MTOC 관련 단백질의 고갈이 감수 스핀들 조직을 방해 완전히 스핀들 조립 검사 점 (SAC) 6,7에 의해 해결되지 않은 난자의 염색체 분리의 오류에 이르게 것을 보여줍니다. 따라서, 감수 체포를 유발하지 않는 스핀들 안정성 결함은 염색체 이수성에 기여에 상당한 위험을 초래할. 스핀들 조립 및 조직, 난자 MTOC의 제자에서의 중요한 역할에도 불구하고EIN 구성과 기능을 제대로 이해 남아 있습니다. 곧 세포의 감수 분열 8,9 재개하기 전에 정지 될 전사적으로 포유류 난자 특정 표적 단백질의 기능을 시험하는 것은 도전적이다. 따라서, 사전 배란 된 난자는 감수 분열을 재개 모성 mRNA의 저장에 의존 감수 분열뿐만 아니라, 시비 10, 11 후 첫 번째 분열 부문을 지원합니다. 포유류의 난자에서 mRNA의 성적 증명서의 RNA 간섭 (RNAi의) 중재 저하의 효능은 잘 확립되어 감수 성숙하는 동안 번역 모집 산모의 RNA는 siRNA를가 12-14을 목표로, 특히 의무가 있습니다. 따라서, 난 모세포에 짧은 간섭 RNA를의 미세 주입 (siRNA를)은 기능 테스트를위한 대상의 mRNA를 고갈 가치있는 접근 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 난자 특정 transcri의 siRNA를 매개 고갈의 분리를위한 방법을 설명PTS는 pericentrin, 필수 MTOC 관련 단백질의 기능을 테스트합니다. 또, 난자의 감수 스핀들 형성을 평가하기 위해 면역 분석 조건을 설명한다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

된 siRNA의 미세 주입은 시험관 내에서 상이한 타겟 요인 효율적이고 고도로 특정 기능을 테스트 할 수 난자의 mRNA의 분해 및 후속 단백질 고갈을위한 효과적인 방법을 제공한다. 이어서, 특정 면역 표현형 분석에 사용 된 siRNA뿐만 아니라 주입 난 모세포에 단백질 고갈을 검증. 현재 예에서, 안티 - 튜 불린 및 안티 pericentrin 항체와 함께 DAPI 개별 난자의 형광 표지를 사용할 수 :뿐만 아니라 per...

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Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다.

siRNA를 매개 음소거로 마우스 난 모세포의 감수 스핀들 평가

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K 조회수.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  여기서는 마우스 난자 감수 스핀들 어셈블리 및 조직을 평가하기 위해 면역 분석 하였다 특정 된 siRNA 매개 mRNA의 파괴를위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 성적 증명서의 체외 고갈과 다른 스핀들 및 / 또는 난자에 MTOC 관련 요인의 기능 평가에 적합합니다. 

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Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

마우스 Oocytes에 핵 전송

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

연구

생물학

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

마우스 Oocytes의 검색

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

머릿속 RNA 현지화에서 Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...