This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

وقد وافق هذا البروتوكول من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة جورجيا. 1. الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للثقافة بويضة أو شراء أو طازجة إعداد الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) وتكملة مع 3 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) كما هو مبين في الجدول رقم 1 ضع زجاجة البوليسترين على التوازن تحميل (الفارغة إلى الصفر). إضافة كافة الكواشف، إلا BSA، في النظام وإظهار الحجم النهائي مع MQ-المياه وزنا إلى ما مجموعه 250 غرام. قم بإضافة BSA، تسمح بحل وتصفية تعقيم. ملاحظة: MEM المتوسطة وصفها يتطلب موازنة وحضانة خلية تحتوي على خليط الغازات الطبية من 5٪ CO 2، 5٪ O 2 و 90٪ N 2. لكن وسائل إعلام أخرى (على سبيل المثال، CZB) يمكن استخدامها التي تسمح للحضانة خلية في 5٪ CO 2 تحت الظروف الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالبويضة microinjection، شراء أو تحضير M2 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير صفرس النهج السائد في المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) إلى تركيز 5 وحدة دولية / 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء وإعادة الأسهم سيرنا إلى تركيز العمل من 1 ميكرومتر. </li></ol> 2. ماوس سيت مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 1: لتحفيز التنمية جراب المبيض وزيادة عدد بصيلات ما قبل التبويض، وإدارة 5 وحدة دولية من PMSG البريتونى لإناث الفئران 48 ساعة قبل جمع البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 3: لجمع البويضة والثقافة، وإعداد أطباق ثقافة 35 ملم مع 3 مل من MEM / BSA تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل ميلرينون. يحافظ هذا المانع phosphodiesterase البويضات في الطور الأول-I اعتقال ويمنع انهيار حويصلة جرثومي (GVBD). تتوازن أطباق الثقافة في خليط الغازات الطبية لمدة 15 دقيقة على الأقل. مطلوب ميلرينون وسائل الإعلام في جميع أنحاء تستكمل جمع البويضة، وكذلك البويضة microinjection و24 ساعة الانتظار ثقافة فترة ما بعد سيرنا: مذكرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد المبيضين من إناث الفئران باستخدام مختبر أنشئت يمارس 15 ونقل إلى صحن الثقافة الجديد مع قبل حرارة ومعايرتها MEM / BSA / ميلرينون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق الثقافة في مرحلة من مراحل stereomicroscope لجمع البويضة. الإفراج الركامية-بويضة المجمعات (COC ل) من خلال ثقب الجريبات الغارية مع 27 الإبر G يدويا. إصلاح مبيض واحد إلى أسفل الطبق الثقافة، مع إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل، واستخدام إبرة الثانية لثقب جميع المسام الكبيرة. كرر لكل المبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إجراءات الفم pipetting لالقياسية أو غيرها من وسائل تطلع البويضة، وجمع كل البويضات التي تحيط بها 2 أو أكثر من طبقات من الخلايا الركامية المدمجة. نقل وCOC إلى طبق جديد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الخلايا الركامية المحيطة المتكررة pipetting لطيف مع ماصة 1 مل تعيينها إلى حجم الطموح من 750 ميكرولتر. كرر الخطوة pipetting لحوالي 12 مرةوالسماح للبويضات لاسترداد لمدة 5 دقائق. تستمر بهذه الطريقة حتى كل أو قد أزيلت معظم الخلايا الركامية. نقل البويضات الجرداء إلى صحن ثقافة أخرى والسماح للتوازن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخصيص البويضات الجرداء إلى ثلاث مجموعات تجريبية لاستخدامها في: (ط) Microinjection من الرناوات siRNAs محددة مقابل هدف الفائدة، (ب) Microinjection من غير محددة (مراقبة) الرناوات siRNAs، و (ج) مجموعة غير حقن السيطرة لحساب شروط الثقافة. </li></ol> 3. سيت Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق الثقافة مع 3 مل سائل الاعلام M2 تستكمل مع ميلرينون (1 ميكروغرام / مل) للبويضة microinjection. إعداد أطباق الثقافة التي تحتوي على MEM / BSA / ميلرينون لغسل والثقافة لاحقة من البويضات حقن. ملاحظة: M2 المتوسطة يحتوي HEPES العازلة ويتطلب قبل الاحترار عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تحت الظروف الجوية. يتطلب MEM ما قبل ارتفاع درجات الحرارة وموازنة باستخدام الغازات الطبية وصفهد أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نظام microinjection. تحميل إبرة الحقن مع 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر حل سيرنا محددة. تأمين ماصة عقد وحقن إبرة لmicromanipulators النظام microinjection وانشاء وحدة حقن مع حجم والضغط معايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الإعلام في الداخل غطاء صحن الثقافة 3 سم وإضافة بويضة لإعداد والمواءمة بين نظام microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام بويضة كدليل، وضبط مواقف القابضة وحقن الإبر. تطبيق الضغط السلبي على ماصة عقد لتأمين بلطف البويضة وضبط الموقف من إبرة الحقن على أوسع قطر للخلية. ضبط الإعدادات لتسمح Microinjection من حوالي 10 رر من الحل سيرنا في أي مكان في سيتوبلازم البويضة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> تعيين الرقم 1. البويضة microinjection تصل. ( <stroنانوغرام&gt; أ) صورة الممثل من 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من M2 وسائل الاعلام وضعت على غطاء من صحن الثقافة 3 سم، مع ماصة عقد وحقن الإبرة وضعه على اليسار واليمين، على التوالي. (B) مجموعة من الطور الأول-I اعتقال البويضات (GV-المرحلة) قبل microinjection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة غطاء لمرحلة stereomicroscope وإضافة 200 ميكرولتر الدقيقة قطرة من وسائل الاعلام M2 الطازجة. إضافة مجموعة من البويضات (~ 10) إلى الانخفاض الجزئي من قبل pipetting الفم، أو الطرق البديلة، ثم يعود الغطاء مع انخفاض الصغير إلى مرحلة microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى microinject البويضات الفردية. تأمين بويضة واحدة مع ماصة عقد، تضاف ببطء غيض من إبرة الحقن في السيتوبلازم وطرد حجم الحقن من حل سيرنا. سحب بعناية إبرة الحقن ومولقد البويضة المحقونة إلى موضع في الجزء السفلي من الهبوط الجزئي. نقل البويضات حقن دون جدوى لوضع في الجزء العلوي من الانخفاض الجزئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء microinjection مع كل بويضة. للحفاظ على أفضل قابلية البويضة، microinject سوى عدد قليل من البويضات في كل مرة. تأكد من أن هذه العملية لا تستغرق أكثر من بضع دقائق لمنع درجة الحرارة ودرجة الحموضة التغييرات في الانخفاض الجزئي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح حقن بنجاح البويضات أو نقل بعناية غطاء مع انخفاض الصغير من البويضات حقن لstereomicroscope. نقل البويضات القابلة للحياة حقن من قبل pipetting الفم أو طرق بديلة، إلى ذاكرة / BSA / ميلرينون المتوسطة لغسل وتتوازن عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجموعة أخرى من البويضات، كرر العملية microinjection مع إبرة حقن جديدة محملة الرناوات siRNAs غير محددة لمجموعة المراقبة. غسل البويضات في MEM / BSA / ميلرينون ونقل إلى صحن الثقافة منفصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة جميع فئاتالبويضات لمدة 24 ساعة في MEM / BSA / ميلرينون عند 37 درجة مئوية تحت جو من الغاز الطبي. ملاحظة: مطلوب &quot;كتلة ميلرينون&quot; فترة ثقافة للهدف كفاءة نضوب مرنا / البروتين. </li></ol> 4. سيت الثقافة للنضوج الانتصافي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 4: لكل المجموعة التجريبية البويضات انشاء 4 أطباق الثقافة (35 ملم) مع 3 مل MEM / BSA. تكملة طبق وسائل الإعلام واحد لكل مجموعة مع 10٪ (جودة عالية) مصل بقري جنيني (FBS) لاستخدامه في نضوج البويضة. السماح لجميع الأطباق الثقافة لكي تتوازن عند 37 درجة مئوية مع خليط الغازات الطبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق سراح البويضات من &quot;كتلة ميلرينون، بالتتابع غسل البويضات ثلاث مرات في الأطباق التي تحتوي على MEM / BSA ومن ثم نقل البويضات إلى الطبق النضج تحتوي على وسائل الإعلام مع 10٪ FBS. ثقافة جميع الفئات البويضة لمدة 17 ساعة على 37 درجة مئوية، لتمكين استئناف وتطور الانقسام الاختزالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 5: إعداد الحلول لبويضة fixaنشوئها، بما في ذلك: (ط) بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في المخزن بيم (100 أنابيب ملي [الرقم الهيدروجيني 6،9]، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم EGTA) مع 0.5٪ تريتون-X 100، و (ثانيا) تستكمل برنامج تلفزيوني مع 5 FBS٪ التي سيتم استخدامها لغسل ومنع البويضات. ملاحظة: تتطلب هذه الحلول الاحترار مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل البويضة التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتثبيت البويضة (بعد ثقافة 17 ساعة)، بسرعة نقل كل مجموعة التجريبية من البويضات قبل pipetting الفم أو الأساليب البديلة في الآبار الفردية (طبق 4 جيدا) التي تحتوي على 750 ميكرولتر من قبل حرارة 4٪ PFA حل واحتضان عند 37 ° C لمدة 1 ساعة. بعد ذلك يغسل كل مجموعة من البويضات 3 مرات (15 دقيقة لكل منهما) في 750 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تحسنت تحتوي على 5٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات كتلة في 200 ميكرولتر PBS / 5٪ FBS O / N عند 4 درجات مئوية للحد من الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. </li></ol> 5. تحليل المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DAY 6: يتم المناعية في لوحة متعددة جيدا وشركة النفط العمانية: مذكرةيتم نقل ytes متسلسل إلى الآبار متتابعة، التي تحتوي على حلول الأجسام المضادة وغسل منها. إما 48 أو 96-جيدا لوحات يمكن استخدامها، ببساطة ضبط حجم حل يقوم على حجم جيد. لوحات 96-جيدا استخدام 200 ميكرولتر لكل بئر. يتم نقل البويضات إلى حلول مختلفة في الترتيب التالي: حل الأجسام المضادة الأولية - 3 آبار غسل - حل الضد الثانوية - 3 آبار غسل. للحد من التعرض للضوء لوحة يمكن تغطيتها بورق. إعداد الطازجة PBS / 5٪ FBS واستخدام هذا الحل لإعداد التخفيفات الأجسام المضادة (مثل أرنب المضادة للpericentrin (1/1000)، والماوس مكافحة تويولين (1/1000)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات ثابتة من كل مجموعة التجريبية لالآبار الفردية التي تحتوي على 200 ميكرولتر (أو 100 ميكرولتر، إذا كانت هناك رغبة أقل حدة التخزين) من حل الأجسام المضادة الأولية وتغطية البئر مع parafilm. احتضان وفقا لشروط محددة الضد الأمثل (على سبيل المثال، 37 ° C لمدة 1 ساعة أو 4 درجات CO / N). ملاحظة: dilutio الأجسام المضادة الأوليةن وكذلك فترة حضانة معينة ودرجة الحرارة يتطلب اختبار لتحديد الظروف المثلى لالأجسام المضادة المختلفة المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق (على سبيل المثال، 1/1000 تخفيف المضادة للأرنب ومكافحة فأر الأجسام المضادة مترافق مع fluorochromes من أطوال موجية مختلفة). احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البويضات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / 5٪ FBS (10-15 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة غسل النهائي، ونقل البويضات على شريحة زجاجية نظيفة بلطف ونضح أي حل غسل الزائد. وهذا لشل حركة البويضات على سطح الزجاج. إضافة 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام (التي تحتوي على دابي) وتراكب بعناية وسائل الإعلام المتصاعدة مع 22 مم × 22 مم زلة تغطية. خفض ساترة ببطء لتجنب احتباس فقاعات الهواء و / أو إتلاف البويضات. ملاحظة: بدلا من ذلك، للحفاظ على الممتلكات 3-dimentional من بويضة للتحليل المجهري متحد البؤر، إضافة كمية صغيرة من 100 الخرز الزجاجي ميكرون (مختلطة مع الفازلين) إلى زوايا من انزلاق الغطاء قبل تصاعد على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر الشرائح في 4 درجات مئوية، أو الشروع في تقييم التقدم الانتصافي وكذلك تحليل مستويات التعبير والتحت خلوية البروتين توطين باستخدام المجهر مضان مجهزة مرشحات اللازمة لتتناسب مع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes.">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance.">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

في حين أن هناك أساليب متعددة لنقل خارجي حامض النووي في الخلايا الجسدية، مثل Electroporation للوترنسفكأيشن، microinjection هو الأسلوب الأمثل للتسليم من جزيئات الحمض النووي الريبي في البويضات الماوس هادئة transcriptionally. وينص البروتوكول الحالي نهج فعال لفي المختبر استنزاف من mRNAs م?...

الانقسام الاختزالي هو عملية تقسيم الفريدة التي تحدث في الأمشاج (البويضات والحيوانات المنوية) وينطوي على قسمين متتالية دون التدخل تخليق DNA لفصل الكروموزومات المتماثلة والصبغيات الشقيقة خلال الانقسام الاختزالي-I والانقسام الاختزالي الثاني على التوالي 1. أخطاء في كروموسوم العزل خلال الميتوزي في البويضات يمكن أن يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات، وهي التي ورثها الجنين أثناء الإخصاب. ومن الجدير بالذكر أن حدوث عدم توازن الصبغيات في الأجنة النامية يزيد مع تقدم عمر الأم وسبب رئيسي من العيوب الخلقية، فضلا عن فقدان الحمل في النساء 1،2، وبالتالي، مما يؤكد حاجة مهمة لفهم الأساس الجزيئي لعدم توازن الصبغيات أثناء الانقسام الانتصافي . أثناء انقسام الخلية، الصبغي الفصل يعتمد بشكل حاسم على تجميع جهاز أنيبيب المغزل وإنشاء مستقرة التفاعلات كروموسوم أنيبيب لمرفق الصحيح لالمغزل المعاكسالقطبين. الأهم من ذلك، تشكيل المغزل الانتصافي في البويضات الثدييات يختلف من الانقسام في الخلايا الجسمية، وتنظمه مراكز تنظيم أنيبيب فريدة من نوعها (MTOCs) التي تفتقر centrioles 3،4. البروتينات الضرورية اللازمة لالتنوي أنيبيب وتنظيم توطين لMTOCs البويضة، بما في ذلك γ تويولين أن يحفز التجمع أنيبيب. بالإضافة إلى ذلك، pericentrin الوظائف باعتبارها بروتين السقالات الضروري، الذي يربط والمراسي γ تويولين فضلا عن عوامل أخرى في MTOCs 5. والجدير بالذكر أن تظهر دراستنا أن استنزاف من البروتينات الرئيسية MTOC المرتبطة يعطل منظمة المغزل الانتصافي ويؤدي إلى أخطاء كروموسوم الفصل في البويضات التي لم يتم حلها بشكل كامل من قبل حاجز الجمعية المغزل (SAC) 6،7. ولذلك، عيوب في الاستقرار المغزل، التي لا تؤدي إلى اعتقال الانتصافي، تشكل خطرا كبيرا في المساهمة في عدم توازن الصبغيات. وعلى الرغم من دورها الأساسي في التجمع المغزل والتنظيم، بروت البويضة MTOCتكوين عين وظيفة تزال غير مفهومة تماما. اختبار وظيفة البروتينات المستهدفة المحددة في البويضات الثدييات هي صعبة، إذ تصبح الخلايا هادئة transcriptionally قبل استئناف الانقسام الاختزالي 8،9 قريبا. وبالتالي، البويضات ما قبل التبويض تعتمد على مخازن مرنا الأمهات لاستئناف الانقسام الاختزالي ودعم الميتوزي فضلا عن الانقسامات انشقاق الأولى بعد الإخصاب 10،11. وراسخة فعالية تدخل الحمض النووي الريبي (رني) تدهور بوساطة من النصوص مرنا في البويضات الثدييات والرنا الأمهات تجنيدهم للترجمة خلال نضوج الانتصافي قابلة بشكل خاص لسيرنا استهداف 12-14. ولذلك، Microinjection من الرنا التدخل قصيرة (الرناوات siRNAs) إلى البويضات يوفر نهجا قيما لتستنزف من mRNAs المستهدفة للاختبار وظيفي. هنا، نحن تصف طرق لعزل البويضات الماوس واستنزاف بوساطة سيرنا من transcri محددةنقطة لاختبار وظيفة البروتين الضروري MTOC المصاحب، pericentrin. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف الظروف التحليل المناعي لتقييم تكوين المغزل الانتصافي في البويضات.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

يوفر Microinjection من الرناوات siRNAs نهج فعال لتدهور مرنا واستنزاف البروتين لاحق في البويضات، والتي تمكن الاختبارات الوظيفية بكفاءة ومحددة للغاية من العوامل المستهدفة المختلفة في المختبر. بعد ذلك، يتم استخدام المناعي للتحليل النمط الظاهري محدد وكذلك للتحقق من صحة اس?...

Watch this Scientific Journal Video about Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing at JoVE.com

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل المرتبطة MTOC في البويضات.

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  هنا، نقدم بروتوكول معين استنزاف مرنا بوساطة سيرنا تليها التحليل المناعي لتقييم الجمعية المغزل الانتصافي والتنظيم في البويضات الماوس. هذا البروتوكول هو مناسبة لفي المختبر استنزاف النصوص والتقييم الوظيفي للمغزل مختلفة و / أو عوامل ال?...

Video: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

نقل النووي في البويضات ماوس

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

استرجاع البويضات ماوس

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection من البويضات المورق القيطم

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

تصور التعريب في الحمض النووي الريبي القيطم البويضات

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

قياس الكاتيونات النقل من نا، K-H و، K-أتباز في<em&gt; القيطم</em&gt; البويضات بواسطة الامتصاص الذري الطيفي: بديل لفحوصات النظائر المشعة

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...