この作品は公演され、ウースター工科大学でサポートされています。

1。 線虫成長媒体の準備 (NGM) <ol><li>1 L メディアのため寒天 20 g、2.5 g 有機窒素源 (例えば、バクト ペプトン)、および 2 L フラスコの塩化ナトリウム 3 g を組み合わせます。975 mL の滅菌水を追加します。
	<ol>滅菌攪拌棒で <li>追加。15 分の自動メディアの注ぎ口、オートクレーブ チューブとメディアを使用している場合メディアする必要がありますのオートクレーブもはや高いボリュームを作った場合</li>。
	</ol></li> <li>撹拌プレートでメディアを設定し、冷却すること。
	<ol><li>メディアが無菌 (約 60 ° C) を触ると暖かく追加 1 M MgSO 4 の 1 mL &#9679; H 2 O、1 M CaCl 2 の 1 mL、KPO 4、25 mL、1 mL のエタノールで 0.5% コレステロール</li>。
		<li>メディア (手動で、または自動ポンプ) 流の下に入れて 35 × 10 mm 滅菌シャーレ。使用する前に 1-2 日のフードの下で乾かします 。
		注: プレートは汚染防止のための 4 ° C で保存する必要があります</li>。
	</ol></li></ol> 2。ワームのピックアップを作る <ol><li>アルミ線の 1.5 cm 部分をカットします。パスツール ピペットの先端に約 0.5 cm の長さを慎重に挿入します。
	<ol><li>炎のピペットにピペット チップの元の形状を損なうことがなくワイヤを安全に付着するまでゆっくりと回転してガラス ピペット チップを溶かすブンゼン バーナー、アルコール ランプを使用しています</li>。
	</ol></li></ol> 3。大腸菌 培養の準備 <ol><li>滅菌ループを使用して、大腸菌 OP50 ルリア スープ 200 mL に 単一コロニーを接種します。37 で揺れで一晩インキュベート ° C</li>
	<li>液体培養は使用次の日の準備ができて、使用しないときは 4 ° C で保存されるかもしれない 。
	注: OP50、エシェリヒア属大腸菌 株の食物源として使用されて 線虫。この文化に使用するかもしれないいくつかの 4 に格納されているときに数ヶ月まで ° c.</li>
</ol> 4。本質的な c. の elegans メンテナンス <ol><li>プレートの中央に準備された OP50 液体培養の約 50-100 μ L をスポッティングにより NGM 寒天で 大腸菌 を作製した種子</li>。
	<li>カバー プレート、および 24 時間室温で乾燥させます。一度乾燥し、急速な成長のために夜通しの 37 ° C でプレートを配置またはより遅い成長が必要な場合、室温で維持します</li>。
	<li>プレートにワームを追加いずれか &#34;、&#34; (プロトコル手順 5 を参照してください &#34; Chunking やピッキング ワーム &#34;)、ワームを個別に選択または直接プレート ワームの卵を配置すること (プロトコル手順 6 を参照してください &#34; 卵準備 &#34;).</li>
</ol> 5。Chunking やピッキング ワーム 注: &#34;、&#34; c. の elegans の保守に共通する方法を示します。これは、ワームを含む NGM 寒天プレート部を切り、新しい板にこの作品を転送するもプロセスのワームの大規模な数を転送するために含まれます。汚染は、この方法でプレートから切り出されることがあります。ワームを選ぶときは、寒天の穴にワームを失われることが寒天の整合性を維持するために重要です。さらに、寒天を溶解またはワームを燃焼を防ぐためにプレートに触れる前に冷却するための選択をできるようにすることが重要だ。
<ol>新しいプレートの上にワームの大量を迅速に転送するために <li>は、へらを使用して選択したワームを含む NGM 寒天の部分をカットしました。カットの部分を削除し、新しいプレートの OP50 の芝生の端に顔ダウン配置します</li>。
	<li>転送プロトコル手順 8.2 で下記のとおり個別にワーム &#34; 生存分析、&#34; ワームを使用してを選択します。それが赤になるまで炎ワームでワイヤーを選択します。炎から外し、数秒間冷却します</li>。
	<li>ピックにワイヤーをカバー、新しいプレート上に成長した OP50 文化の芝生をこすり、ピックにワイヤを使用して優しく</li>。
	<li>ワイヤの先端を覆う粘性の文化により、ワームの選択のヒントに固執する、こうして優しく強打する運動を使用して選択したワームをピックアップします</li>。
	<li>選択したワームが収集され、一度は優しく文化を寒天にスワイプによって新しいプレート上に配置します。ピックに残り文化を削除する炎にワイヤを配置します</li>。
</ol> 6。卵の準備 <ol><li>ピッキングまたはチャンキング プロトコル手順 5 で説明したように約 20 大人動物 (約 20 ° C で育てられたとき、孵化後 2-3 日) に配置 &#34; Chunking とピッキングのワーム、&#34; 50 シード プレートOP50 大腸菌株の μ L.</li>
	卵を収集し、10 mL の M9 バッファーとプレートの洪水の 1-2 日後に <li>。ガラス血清ピペットを使用すると、旋回し、振とう OP50 または大人動物にこだわった卵を解放する寒天プレート上のコンテンツ。成虫と卵を含むすべての液体を収集します</li>。
	<li>15 mL の円錐形に転送 M9 と OP50 ソリューション チューブ。遠心分離機の 2,100 x g で 2 分間で 15 mL の円錐管</li>
	<li>OP50 ペレットを乱すことがなく上澄みの約 9 mL を吸引します</li>。
	<li>2 mL の滅菌水、漂白剤 1 mL と 0.25 M NaOH の 1 mL にペレットを再懸濁します</li>。
	通常、卵はそのまま残りますこの短い漂白剤治療中に、シェルのため <li>はインバージョンによるを穏やかに混合し、大人動物の大半 (およそ 70%) が分離表示されるまでです。遠心分離機の 990 x g で 2 分間で円錐管</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく吸引清。M9 バッファーの 10 mL にペレットを再停止します</li>。
	<li>は、不穏なペレットなし 2 分吸引上澄みの 990 x g で円錐形の管を遠心分離機します。M9 バッファーの 200 μ L でペレットを再停止します 。
	注: 卵の準備は、複数の試験を必要があります。彼らは長すぎるため漂白剤にさらされている場合、卵を破壊可能性があります。卵は孵化しない場合、漂白剤溶液中の濃度を減少または漂白剤への露出の期間が減少します</li>。
</ol> 7。感染症板セットアップ <ol><li>YPD 滅菌試験管に 3 ~ 5 mL を省略し、カンジダ ・ アルビカンス 滅菌ループを使用して単一コロニーで接種します。
	<ol><li>30 で約 16-18 時間回転ドラムにチューブを配置 ° C</li>
	</ol></li> <li>ラベル 1 つ 1.5 mL および microfuge チューブ c. アルビカンス、および別の OP50 を含むを格納します。それぞれの空の管の重量を記録。
	<ol><li>一晩チューブに C. albicans 文化の場所 500 μ L 標識 C. albicans と一晩 OP50 文化 (ステップ 3.1) からの 1,500 μ L OP50 というラベルの付いたチューブにします</li>。
		<li>G. 吸引清不穏なペレットなし x 16,100 で 10 分間遠心します</li>。
		<li>は再 500 μ L の滅菌水でペレットを中断します。16,100 x g. で 5 分間遠心</li>
		<li>ペレットを乱すことがなく吸引清。Microfuge の管の最終的な重量を記録します</li>。<li>最終的な重量から microfuge の管の初期の重量を差し引くことによって各ペレットの重量を決定します</li>。
	</ol></li> <li>10 mg/ml、C. albicans ペレットと 200 mg/ml OP50 ペレット再中断 滅菌水を使用しています。ストレプトマイシンの 50 mg/mL の溶液を 10 μ l 添加、OP50 文化の 2.5 μ L、c. アルビカンス 文化の 0.5 μ L 7 μ L の滅菌水を組み合わせることによりミックス マスター感染を作る。
	<ol><li>制御板、C. albicans 文化のボリュームを滅菌水に置き換えることによりマスター ミックスを作成します。感染症のミックスやマイクロ ピペットを使用して NGM センター プレートに OP50 制御ソリューションの 20 μ L をシードします 。
		注: 分析中に統計的有意性を決定する約 100 のワームが必要です。この試金は 3 通で通常実行されます。したがって、感染ミックス x 3.2 と同様、制御ソリューション x 3.2 が行われます。これらのミックスは、完全 20 μ L のシードは、各プレート、エラーのための部屋を許可することを確保するため元 × 3 強に作られています。C. アルビカンス を消費する (L1 L3) 初期幼虫段階でワームの咽頭が小さすぎるために、このマスター ミックスが作成されます。フルコナゾール ( 図 3 b) などの薬剤への暴露, エージェントは感染症混合物に導入します。剤の濃度を経験的に決まります。たとえば、 図 3 b、50 μ M のフルコナゾールを表され、0、12.5、25、50、100 μ M フルコナゾールもいたが同じプロトコルを使用してテストします</li>。
	</ol></li></ol> 8。肛門領域の変形 (Dar) 表現型と生存の試金の分析 <ol><li>視覚化 Dar 表現型 注: L3 期とそれ以降に最適ダルな可視化します。Dar は、時間の経過とともに顕著となる ( 図 2 a)、ワームのポスト肛門領域に小さな突起として提示します。
	<ol><li>動物解剖顕微鏡のステージ上プレートをすばやくタップして Dar; Dar と動物がどちらかの必要になりますすぐに後方移動 Dar はなく動物を持っている場合確認繰り返し逆方向、または彼らにタップのラウンド全然しません</li>。
	</ol></li> <li>生存分析 <ol><li>プロトコル手順 6 で前述したように完全な卵の準備 &#34; 卵の準備 &#34;。郭清範囲の下で卵をカウントし、μ L あたり約 5-6 健康的な卵の濃度を達成するまでに M9 と卵ソリューションを希釈します。20 μ L の試料を細菌の培養とプレートの側面間の領域の準備の NGM プレート約 30 卵を分配、ピペットを使用して (卵とワームは、食品、OP50、2 つの個別の点では) です</li>。
		<li>48 h の 20 ° C に加温プレート。解剖顕微鏡の下で、各プレート上のライブと死んでいる大人のワームの数だけでなく、ダルでワームの数をカウントします。Dar と % を記録します</li>。
		<li>アルミ線またはプレートで軽くたたくことによって頭を叩かれてに応答しない場合に死んだ動物を考慮します</li>。
		<li>毎日、転送残り成虫ピッキングによってプロトコル手順 5 で説明したよう &#34; Chunking とピッキングのワーム、&#34; 新しい感染症やコントロール プレートに。この時点で、必要な場合は毎日ライブ、死者および行方不明の虫の数を追跡することによって生存分析を実行します 。
		注: このアッセイを卵の準備を始めて 2 週間、実行可能性があります。さらに、卵ソリューション ソリューションは、OP50 を殺すことができる漂白剤の痕跡を含む場合がありますので、細菌培養には調剤していないします。ソリューション必要があります卵寒天プレートの側面の間に挟まったように、プレートの端から約 0.5 cm を調剤します。さらに、ワームの急速な普及、により転送新しいプレートの上に大人は彼らの子孫とは異なる重要な</li>。
	</ol></li> <li>分析生存 <ol><li>生存曲線の解析ソフトウェアを用いた結果の分析 (資料の一覧を参照してください).</li>
		<li>比較生存曲線 Grehan ・ ブレスロウ Wilcoxon メソッドを使用して (初期の生存期間からデータが後の時代よりも正確、重量データに応じて) だけでなく、各統計ツール 45 。
		注: たとえば、 図 4 b に -C、同質遺伝子野生型コントロールや complementarystrains で治療にワーム変異体 C. albicans で治療の生存率を比較します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

別の病原体をテストするためについてはC. albicansに一生さらされる線虫感染症や生存を試金する方法を変更できます。別の細菌または菌の液体培養したし、同様の方法でc. の elegansを供給します。シリアルの感染可能性がありますさらに、試金する前述のように、まず 1 つの病原体に幼虫を公開し、成人期に達した後別の病原体を含む新しいプレート上に動物を移すことに...

線虫は、50 年以上の強力なモデル有機体として使用されています。1960 年代、南アフリカ共和国の生物学者、シドニー ・ ブレナーは、線虫の細胞および動物の生物学の様々 な面を調査する科学者たちの長い系統の道を舗装神経の開発、研究にc. の elegansの使用を開拓しました。この系譜は、ノーベル賞受賞者クレイグ ・ メローとの RNAi の仕事1のアンドリュー ・ ファイアー、ロバート ・ ホロビッツ、ジョン ・ サルストン器官形成およびアポトーシス2,3,4、自分の仕事のため、マーティン ・ チャルフィー緑色蛍光タンパク質5彼の仕事。研究者が緑膿菌を含む様々 な人間の病原体の生物学を調査するためにc. の elegansを使用し始めているこのモデル有機体は、伝統的に過去の 15 年にわたって分子発生学を研究に使用されていますが緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、セラチア6,7,8,9,10。これらの研究は人間-病原体相互作用に関与するメカニズムの多くが保存されます明らかに線虫がまたこのモデル生物11,12に固有いくつかの免疫機構があります。自然の中でc. の elegansさまざまな土で現在の摂取された病原体からの脅威、これが進化し、腸管内の洗練された自然免疫系を維持する強力な選択圧を提供しています。遺伝子や腸管の保護に関与するメカニズムの多くが高い哺乳類11,13にも存在する非常に節約される要素によって調整されます。線虫は、したがって14サルモネラ、赤痢菌 boydii15、またはコレラ16のような消化管病原体を研究する素晴らしいモデルを表します。
ここで我々 は線虫のc. アルビカンスなど感染性病原体を研究するモデルのホストとしての驚くべき多様性を強調表示します。線虫モデルのホストとしては安価でカンジダ症42の研究に用いられるマウスのモデルよりも時間のかかる病原性の高スループット スクリーニングが可能です。
本研究では、このモデルと厚板の生存分析確実に使えるホスト生得免疫エフェクター ドライブの病原性病原体の決定要因、感染症に対抗する重要な留学を紹介し、薬理学的化合物のことができます。病因に介入します。前述の試金に異なる、このメソッドは、成人だけではなく、成人期、幼虫期から死43,44動物の生涯にわたって病原体への暴露を勉強するための手段を提供します。要約すると、我々 はc. の elegans - C. albicansモデルは、ドライブの感染・免疫遺伝的基盤を研究するだけでなく、治療的介入のための新しい化合物を識別するためにも使用できる汎用性と強力なツールです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

モデルのホストとして線虫を使用して微生物の相互作用を研究する手法を示す.微生物は、腸疾患の主な場所を作る食事を介して紹介しています。線虫の腸管構造的、機能的哺乳類の腸を模倣し、透明な植民地化の微視的研究に従うことです。病原体が病気や死を引き起こす可能性ことを示します。我々 は変更された病原性を示す微生物の突然変異を識別することができます。生物的ストレスに保存された生得的な応答は、宿主自然免疫の面を調査する優秀なシステムを線虫になります。デュアル酸化酵素遺伝子の変異を持つホスト反応酸素種を作り出すことができないし、微生物の侮辱に抵抗することができないことを示す.さらにそれが微生物の増殖阻害剤の効果を研究する使用することができますを示すにより提示された生存分析の汎用性を示します。この試金を使用して、さらに宿主微生物間相互作用を明らかにする機会を提供すると同様、新規抗真菌薬の開発のためのターゲットとして真菌病原因子を発見するも可能性があります。この試金のデザインによく適して高スループット全ゲノム スクリーン、将来使用するための低温保持するワームに能力になりますが勉強するコスト効果の高い魅力的な全体の動物モデル。

C. アルビカンスと線虫を使用して病因分析 (図 1) は、私たちラボ17,18して他ラボ19,20以前記載されています。線虫を使用してC. albicans細胞ワームがすぐに摂取が遅い歩行を引き起こす腸の内腔に蓄積されることを示すc. アルビカ?...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト モデルとして線虫線虫を紹介します。

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

遺伝学

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

生体内で単純および複雑な DNA 損傷に対する細胞応答を研究するレーザー Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

大規模混合ステージ カエノハブディティス・エレガンス集団の 文化とアッセイ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...