Name: the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
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1。 線虫成長媒体の準備 (NGM) <ol><li>1 L メディアのため寒天 20 g、2.5 g 有機窒素源 (例えば、バクト ペプトン)、および 2 L フラスコの塩化ナトリウム 3 g を組み合わせます。975 mL の滅菌水を追加します。
	<ol>滅菌攪拌棒で <li>追加。15 分の自動メディアの注ぎ口、オートクレーブ チューブとメディアを使用している場合メディアする必要がありますのオートクレーブもはや高いボリュームを作った場合</li>。
	</ol></li> <li>撹拌プレートでメディアを設定し、冷却すること。
	<ol><li>メディアが無菌 (約 60 ° C) を触ると暖かく追加 1 M MgSO 4 の 1 mL &#9679; H 2 O、1 M CaCl 2 の 1 mL、KPO 4、25 mL、1 mL のエタノールで 0.5% コレステロール</li>。
		<li>メディア (手動で、または自動ポンプ) 流の下に入れて 35 × 10 mm 滅菌シャーレ。使用する前に 1-2 日のフードの下で乾かします 。
		注: プレートは汚染防止のための 4 ° C で保存する必要があります</li>。
	</ol></li></ol> 2。ワームのピックアップを作る <ol><li>アルミ線の 1.5 cm 部分をカットします。パスツール ピペットの先端に約 0.5 cm の長さを慎重に挿入します。
	<ol><li>炎のピペットにピペット チップの元の形状を損なうことがなくワイヤを安全に付着するまでゆっくりと回転してガラス ピペット チップを溶かすブンゼン バーナー、アルコール ランプを使用しています</li>。
	</ol></li></ol> 3。大腸菌 培養の準備 <ol><li>滅菌ループを使用して、大腸菌 OP50 ルリア スープ 200 mL に 単一コロニーを接種します。37 で揺れで一晩インキュベート ° C</li>
	<li>液体培養は使用次の日の準備ができて、使用しないときは 4 ° C で保存されるかもしれない 。
	注: OP50、エシェリヒア属大腸菌 株の食物源として使用されて 線虫。この文化に使用するかもしれないいくつかの 4 に格納されているときに数ヶ月まで ° c.</li>
</ol> 4。本質的な c. の elegans メンテナンス <ol><li>プレートの中央に準備された OP50 液体培養の約 50-100 μ L をスポッティングにより NGM 寒天で 大腸菌 を作製した種子</li>。
	<li>カバー プレート、および 24 時間室温で乾燥させます。一度乾燥し、急速な成長のために夜通しの 37 ° C でプレートを配置またはより遅い成長が必要な場合、室温で維持します</li>。
	<li>プレートにワームを追加いずれか &#34;、&#34; (プロトコル手順 5 を参照してください &#34; Chunking やピッキング ワーム &#34;)、ワームを個別に選択または直接プレート ワームの卵を配置すること (プロトコル手順 6 を参照してください &#34; 卵準備 &#34;).</li>
</ol> 5。Chunking やピッキング ワーム 注: &#34;、&#34; c. の elegans の保守に共通する方法を示します。これは、ワームを含む NGM 寒天プレート部を切り、新しい板にこの作品を転送するもプロセスのワームの大規模な数を転送するために含まれます。汚染は、この方法でプレートから切り出されることがあります。ワームを選ぶときは、寒天の穴にワームを失われることが寒天の整合性を維持するために重要です。さらに、寒天を溶解またはワームを燃焼を防ぐためにプレートに触れる前に冷却するための選択をできるようにすることが重要だ。
<ol>新しいプレートの上にワームの大量を迅速に転送するために <li>は、へらを使用して選択したワームを含む NGM 寒天の部分をカットしました。カットの部分を削除し、新しいプレートの OP50 の芝生の端に顔ダウン配置します</li>。
	<li>転送プロトコル手順 8.2 で下記のとおり個別にワーム &#34; 生存分析、&#34; ワームを使用してを選択します。それが赤になるまで炎ワームでワイヤーを選択します。炎から外し、数秒間冷却します</li>。
	<li>ピックにワイヤーをカバー、新しいプレート上に成長した OP50 文化の芝生をこすり、ピックにワイヤを使用して優しく</li>。
	<li>ワイヤの先端を覆う粘性の文化により、ワームの選択のヒントに固執する、こうして優しく強打する運動を使用して選択したワームをピックアップします</li>。
	<li>選択したワームが収集され、一度は優しく文化を寒天にスワイプによって新しいプレート上に配置します。ピックに残り文化を削除する炎にワイヤを配置します</li>。
</ol> 6。卵の準備 <ol><li>ピッキングまたはチャンキング プロトコル手順 5 で説明したように約 20 大人動物 (約 20 ° C で育てられたとき、孵化後 2-3 日) に配置 &#34; Chunking とピッキングのワーム、&#34; 50 シード プレートOP50 大腸菌株の μ L.</li>
	卵を収集し、10 mL の M9 バッファーとプレートの洪水の 1-2 日後に <li>。ガラス血清ピペットを使用すると、旋回し、振とう OP50 または大人動物にこだわった卵を解放する寒天プレート上のコンテンツ。成虫と卵を含むすべての液体を収集します</li>。
	<li>15 mL の円錐形に転送 M9 と OP50 ソリューション チューブ。遠心分離機の 2,100 x g で 2 分間で 15 mL の円錐管</li>
	<li>OP50 ペレットを乱すことがなく上澄みの約 9 mL を吸引します</li>。
	<li>2 mL の滅菌水、漂白剤 1 mL と 0.25 M NaOH の 1 mL にペレットを再懸濁します</li>。
	通常、卵はそのまま残りますこの短い漂白剤治療中に、シェルのため <li>はインバージョンによるを穏やかに混合し、大人動物の大半 (およそ 70%) が分離表示されるまでです。遠心分離機の 990 x g で 2 分間で円錐管</li>
	<li>ペレットを乱すことがなく吸引清。M9 バッファーの 10 mL にペレットを再停止します</li>。
	<li>は、不穏なペレットなし 2 分吸引上澄みの 990 x g で円錐形の管を遠心分離機します。M9 バッファーの 200 μ L でペレットを再停止します 。
	注: 卵の準備は、複数の試験を必要があります。彼らは長すぎるため漂白剤にさらされている場合、卵を破壊可能性があります。卵は孵化しない場合、漂白剤溶液中の濃度を減少または漂白剤への露出の期間が減少します</li>。
</ol> 7。感染症板セットアップ <ol><li>YPD 滅菌試験管に 3 ~ 5 mL を省略し、カンジダ ・ アルビカンス 滅菌ループを使用して単一コロニーで接種します。
	<ol><li>30 で約 16-18 時間回転ドラムにチューブを配置 ° C</li>
	</ol></li> <li>ラベル 1 つ 1.5 mL および microfuge チューブ c. アルビカンス、および別の OP50 を含むを格納します。それぞれの空の管の重量を記録。
	<ol><li>一晩チューブに C. albicans 文化の場所 500 μ L 標識 C. albicans と一晩 OP50 文化 (ステップ 3.1) からの 1,500 μ L OP50 というラベルの付いたチューブにします</li>。
		<li>G. 吸引清不穏なペレットなし x 16,100 で 10 分間遠心します</li>。
		<li>は再 500 μ L の滅菌水でペレットを中断します。16,100 x g. で 5 分間遠心</li>
		<li>ペレットを乱すことがなく吸引清。Microfuge の管の最終的な重量を記録します</li>。<li>最終的な重量から microfuge の管の初期の重量を差し引くことによって各ペレットの重量を決定します</li>。
	</ol></li> <li>10 mg/ml、C. albicans ペレットと 200 mg/ml OP50 ペレット再中断 滅菌水を使用しています。ストレプトマイシンの 50 mg/mL の溶液を 10 μ l 添加、OP50 文化の 2.5 μ L、c. アルビカンス 文化の 0.5 μ L 7 μ L の滅菌水を組み合わせることによりミックス マスター感染を作る。
	<ol><li>制御板、C. albicans 文化のボリュームを滅菌水に置き換えることによりマスター ミックスを作成します。感染症のミックスやマイクロ ピペットを使用して NGM センター プレートに OP50 制御ソリューションの 20 μ L をシードします 。
		注: 分析中に統計的有意性を決定する約 100 のワームが必要です。この試金は 3 通で通常実行されます。したがって、感染ミックス x 3.2 と同様、制御ソリューション x 3.2 が行われます。これらのミックスは、完全 20 μ L のシードは、各プレート、エラーのための部屋を許可することを確保するため元 × 3 強に作られています。C. アルビカンス を消費する (L1 L3) 初期幼虫段階でワームの咽頭が小さすぎるために、このマスター ミックスが作成されます。フルコナゾール ( 図 3 b) などの薬剤への暴露, エージェントは感染症混合物に導入します。剤の濃度を経験的に決まります。たとえば、 図 3 b、50 μ M のフルコナゾールを表され、0、12.5、25、50、100 μ M フルコナゾールもいたが同じプロトコルを使用してテストします</li>。
	</ol></li></ol> 8。肛門領域の変形 (Dar) 表現型と生存の試金の分析 <ol><li>視覚化 Dar 表現型 注: L3 期とそれ以降に最適ダルな可視化します。Dar は、時間の経過とともに顕著となる ( 図 2 a)、ワームのポスト肛門領域に小さな突起として提示します。
	<ol><li>動物解剖顕微鏡のステージ上プレートをすばやくタップして Dar; Dar と動物がどちらかの必要になりますすぐに後方移動 Dar はなく動物を持っている場合確認繰り返し逆方向、または彼らにタップのラウンド全然しません</li>。
	</ol></li> <li>生存分析 <ol><li>プロトコル手順 6 で前述したように完全な卵の準備 &#34; 卵の準備 &#34;。郭清範囲の下で卵をカウントし、μ L あたり約 5-6 健康的な卵の濃度を達成するまでに M9 と卵ソリューションを希釈します。20 μ L の試料を細菌の培養とプレートの側面間の領域の準備の NGM プレート約 30 卵を分配、ピペットを使用して (卵とワームは、食品、OP50、2 つの個別の点では) です</li>。
		<li>48 h の 20 ° C に加温プレート。解剖顕微鏡の下で、各プレート上のライブと死んでいる大人のワームの数だけでなく、ダルでワームの数をカウントします。Dar と % を記録します</li>。
		<li>アルミ線またはプレートで軽くたたくことによって頭を叩かれてに応答しない場合に死んだ動物を考慮します</li>。
		<li>毎日、転送残り成虫ピッキングによってプロトコル手順 5 で説明したよう &#34; Chunking とピッキングのワーム、&#34; 新しい感染症やコントロール プレートに。この時点で、必要な場合は毎日ライブ、死者および行方不明の虫の数を追跡することによって生存分析を実行します 。
		注: このアッセイを卵の準備を始めて 2 週間、実行可能性があります。さらに、卵ソリューション ソリューションは、OP50 を殺すことができる漂白剤の痕跡を含む場合がありますので、細菌培養には調剤していないします。ソリューション必要があります卵寒天プレートの側面の間に挟まったように、プレートの端から約 0.5 cm を調剤します。さらに、ワームの急速な普及、により転送新しいプレートの上に大人は彼らの子孫とは異なる重要な</li>。
	</ol></li> <li>分析生存 <ol><li>生存曲線の解析ソフトウェアを用いた結果の分析 (資料の一覧を参照してください).</li>
		<li>比較生存曲線 Grehan ・ ブレスロウ Wilcoxon メソッドを使用して (初期の生存期間からデータが後の時代よりも正確、重量データに応じて) だけでなく、各統計ツール 45 。
		注: たとえば、 図 4 b に -C、同質遺伝子野生型コントロールや complementarystrains で治療にワーム変異体 C. albicans で治療の生存率を比較します</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

別の病原体をテストするためについてはC. albicansに一生さらされる線虫感染症や生存を試金する方法を変更できます。別の細菌または菌の液体培養したし、同様の方法でc. の elegansを供給します。シリアルの感染可能性がありますさらに、試金する前述のように、まず 1 つの病原体に幼虫を公開し、成人期に達した後別の病原体を含む新しいプレート上に動物を移すことに...

線虫は、50 年以上の強力なモデル有機体として使用されています。1960 年代、南アフリカ共和国の生物学者、シドニー ・ ブレナーは、線虫の細胞および動物の生物学の様々 な面を調査する科学者たちの長い系統の道を舗装神経の開発、研究にc. の elegansの使用を開拓しました。この系譜は、ノーベル賞受賞者クレイグ ・ メローとの RNAi の仕事1のアンドリュー ・ ファイアー、ロバート ・ ホロビッツ、ジョン ・ サルストン器官形成およびアポトーシス2,3,4、自分の仕事のため、マーティン ・ チャルフィー緑色蛍光タンパク質5彼の仕事。研究者が緑膿菌を含む様々 な人間の病原体の生物学を調査するためにc. の elegansを使用し始めているこのモデル有機体は、伝統的に過去の 15 年にわたって分子発生学を研究に使用されていますが緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、セラチア6,7,8,9,10。これらの研究は人間-病原体相互作用に関与するメカニズムの多くが保存されます明らかに線虫がまたこのモデル生物11,12に固有いくつかの免疫機構があります。自然の中でc. の elegansさまざまな土で現在の摂取された病原体からの脅威、これが進化し、腸管内の洗練された自然免疫系を維持する強力な選択圧を提供しています。遺伝子や腸管の保護に関与するメカニズムの多くが高い哺乳類11,13にも存在する非常に節約される要素によって調整されます。線虫は、したがって14サルモネラ、赤痢菌 boydii15、またはコレラ16のような消化管病原体を研究する素晴らしいモデルを表します。
ここで我々 は線虫のc. アルビカンスなど感染性病原体を研究するモデルのホストとしての驚くべき多様性を強調表示します。線虫モデルのホストとしては安価でカンジダ症42の研究に用いられるマウスのモデルよりも時間のかかる病原性の高スループット スクリーニングが可能です。
本研究では、このモデルと厚板の生存分析確実に使えるホスト生得免疫エフェクター ドライブの病原性病原体の決定要因、感染症に対抗する重要な留学を紹介し、薬理学的化合物のことができます。病因に介入します。前述の試金に異なる、このメソッドは、成人だけではなく、成人期、幼虫期から死43,44動物の生涯にわたって病原体への暴露を勉強するための手段を提供します。要約すると、我々 はc. の elegans - C. albicansモデルは、ドライブの感染・免疫遺伝的基盤を研究するだけでなく、治療的介入のための新しい化合物を識別するためにも使用できる汎用性と強力なツールです。

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

モデルのホストとして線虫を使用して微生物の相互作用を研究する手法を示す.微生物は、腸疾患の主な場所を作る食事を介して紹介しています。線虫の腸管構造的、機能的哺乳類の腸を模倣し、透明な植民地化の微視的研究に従うことです。病原体が病気や死を引き起こす可能性ことを示します。我々 は変更された病原性を示す微生物の突然変異を識別することができます。生物的ストレスに保存された生得的な応答は、宿主自然免疫の面を調査する優秀なシステムを線虫になります。デュアル酸化酵素遺伝子の変異を持つホスト反応酸素種を作り出すことができないし、微生物の侮辱に抵抗することができないことを示す.さらにそれが微生物の増殖阻害剤の効果を研究する使用することができますを示すにより提示された生存分析の汎用性を示します。この試金を使用して、さらに宿主微生物間相互作用を明らかにする機会を提供すると同様、新規抗真菌薬の開発のためのターゲットとして真菌病原因子を発見するも可能性があります。この試金のデザインによく適して高スループット全ゲノム スクリーン、将来使用するための低温保持するワームに能力になりますが勉強するコスト効果の高い魅力的な全体の動物モデル。

C. アルビカンスと線虫を使用して病因分析 (図 1) は、私たちラボ17,18して他ラボ19,20以前記載されています。線虫を使用してC. albicans細胞ワームがすぐに摂取が遅い歩行を引き起こす腸の内腔に蓄積されることを示すc. アルビカ?...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

微生物の相互作用を研究する多彩なホスト モデルとして線虫線虫を紹介します。

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K ビュー.  Worcester Polytechnic Institute. 微生物の相互作用を研究する多彩なホスト モデルとして線虫線虫を紹介します。

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

遺伝学

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

免疫・感染学

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

生物学

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their gut microbiomes. While experiments with well-characterized bacteria or defined bacterial communities can facilitate the analysis of molecular mechanisms, studying nematodes in their natural microbial context is essential for exploring the diversity of such mechanisms. At the same time, the isolation of worms from the wild is not always feasible, and, even when possible, sampling from the wild restricts the use of the genetic toolkit otherwise available for C. elegans research. The following protocol describes a method for microbiome studies utilizing compost microcosms for the in-lab&#160;growth in microbially diverse and natural-like environments.
Locally sourced soil can be enriched with produce to diversify the microbial communities in which worms are raised and from which they are harvested, washed, and surface-sterilized for subsequent analyses. Representative experiments demonstrate the ability to modulate the microbial community in a common soil by enriching it with different produce and further demonstrate that worms raised in these distinct environments assemble similar gut microbiomes distinct from their respective environments, supporting the notion of a species-specific core gut microbiome. Overall, compost microcosms provide natural-like in-lab environments for microbiome research as an alternative to synthetic microbial communities or to the isolation of wild nematodes.

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

Compost microcosms bring the microbial diversity found in nature into the laboratory to facilitate microbiome research in Caenorhabditis elegans. Provided here are protocols for setting up microcosm experiments, with the experiments demonstrating the ability to modulate environmental microbial diversity to explore the relationships between environmental microbial diversity and worm gut microbiome composition.

カエノラブディティス・エレガンスのマイクロバイオーム研究のための微生物的に多様な自然のような環境としての堆肥小宇宙

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their ...

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

要約

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

微生物群集を学びます

病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生のカエノアハブディティス線虫の選択的洗浄

微胞子虫感染症のカエノラブディティス・エレガンスモデルにおける遺伝性免疫の研究

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)によるカエノラブディティスエレガンス腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

単一ワームデータを使用して、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

カエノラブディティス・エレガンスのマイクロバイオーム研究のための微生物的に多様な自然のような環境としての堆肥小宇宙

線虫の宿主微生物間相互作用を研究する多彩なIn Vivoモデル

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

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腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

微胞子虫感染症の カエノラブディティス・エレガンス モデルにおける遺伝性免疫の研究

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

単一ワームデータを使用して 、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化

モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

カエノラブディティス・エレガンスのマイクロバイオーム研究のための微生物的に多様な自然のような環境としての堆肥小宇宙

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単一ワームデータを使用して、Caenorhabditisエレガンス-細菌相互作用における不均一性を定量化