עבודה זו ביצע, נתמך על ידי המכון הפוליטכני וורצ.

1. הכנה של תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) <ol><li>עבור 1 L של מדיה, לשלב 20 גרם אגר, מקור חנקן אורגני 2.5 g (למשל, מה נשארתי-peptone) ו- 3 גר' נתרן כלורי בבקבוקון 2 ל'. להוסיף 975 מ ל מים סטריליים.
	<ol><li>הוספה בבר מערבבים סטרילי. אם משתמש של המשפך מדיה אוטומטי, אבובים אוטוקלב ומדיה למשך 15 דקות; המדיה צריך להיות בלוק עבור יותר אם נפח גבוה יותר עשוי.</li>
	</ol></li> <li>להגדיר את המדיה בצלחת מערבבים ולאחר להתקרר.
	<ol><li>לאחר מדיה חם למגע (כ 60 ° C) גילוח ורחיצה כירורגית להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl 2, 25 מ של KPO 4 ו- 1 מ"ל של 0.5% כולסטרול באתנול.</li>
		<li>שופכים מדיה (ידנית או על ידי משאבת אוטומטית) תחת זרימה שכבתית לתוך 35 מ"מ x 10 מ"מ עקר פטרי. אפשר להתייבש תחת מכסה המנוע של 1-2 ימים לפני השימוש. 
		הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C כדי למנוע זיהום.</li>
	</ol></li></ol> 2. ביצוע של תולעת לבחור <ol><li>לחתוך חתיכה 1.5 ס מ של חוט אלומיניום. בזהירות להוסיף כ 0.5 ס מ באורך הזה לתוך קצה פיפטה פסטר.
	<ol><li>באמצעות מבער בונזן או אלכוהול המנורה, להמיס את הטיפ פיפטה מזכוכית ידי סובבים לאיטם זה ב הלהבה עד הכבל הוא מאובטח דבקה הפיפטה מבלי להתפשר על הצורה המקורית של קצה פיפטה.</li>
	</ol></li></ol> 3. הכנה של e. coli תרבות <ol><li>באמצעות לולאה סטרילי, לחסן שמושבה בודדת של e. coli זן OP50 ב 200 מ ל מרק לוריא. דגירה בין לילה ברעידות-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>התרבות נוזלי מוכן לשימוש ביום המחרת, ניתן לאחסן ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש. 
	הערה: המתח e. coli, OP50, משמש כמקור מזון עבור C. elegans. תרבות זו עשוי לשמש עד כמה חודשים כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 4. חיוני C. elegans תחזוקה <ol><li>זרע שהכין NGM פלטות אגר עם e. coli אכון כ 50-100 µL של תרבות נוזלי מוכן OP50 במרכז הצלחת.</li>
	<li>מכסה צלחות, לאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לאחר יבש, במקום צלחות בגיל 37 ° C בלילה לצמיחה מהירה או לשמור בטמפרטורת החדר, אם צמיחה איטית יותר רצוי.</li>
	<li>להוסיף תולעים לצלחת על-ידי &#34; chunking, &#34; (ראה פרוטוקול שלב 5 &#34; Chunking ותולעים איסוף &#34;), אוסף תולעים בנפרד או הצבת ביצי התולעת ישירות לצלחת (ראה פרוטוקול שלב 6 &#34; ביצה הכנה &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking ותולעים איסוף הערה: &#34; Chunking, &#34; מתייחס שיטה אשר נפוץ ב- C. elegans תחזוקה. זה כרוך חיתוך מקטע של צלחת אגר NGM המכיל תולעים, מעביר את החתיכה הזאת על גבי צלחת חדשה, וכך גם העברת כמות גדולה של תולעים בתהליך. הזיהום עשוי גם לגזור את הצלחת באופן זה. כאשר בוחרים תולעים, חשוב לשמור על היושרה של אגר כי תולעים יכולים ללכת לאיבוד בתוך חורים אגר. בנוסף, חשוב לאפשר האיסוף להתקרר, לפני שתיגע הלוח כדי למנוע התכה של אגר. או לשרוף את התולעים.
<ol><li>על מנת להעביר במהירות כמויות גדולות של תולעים על גבי לוחיות הרישוי, לחתוך חתיכה של אגר NGM המכיל את התולעים שנבחר בעזרת מרית. להסיר את החלק הגזור ולמקם אותו הפרצוף למטה בקצה הדשא של OP50 על צלחת חדשה.</li>
	<li>העברת תולעים בנפרד כמתואר להלן פרוטוקול שלב 8.2, &#34; Assay הישרדות, &#34; באמצעות תולעת לבחור. להבה החוט של התולעת לבחור עד שזה אדום. להסיר אותה הלהבה ולאפשר לו להתקרר למשך כמה שניות.</li>
	<li>בעדינות באמצעות הכבל על האיסוף, לגרד את הדשא של התרבות OP50 גדל על הלוח החדש, המכסים את החוט על האיסוף.</li>
	<li>התרבות צמיגה המכסים את קצה החוט גורם תולעים לדבוק קצה האיסוף, ובכך בעדינות להרים תולעים שנבחר באמצעות תנועה swiping.</li>
	<li>ברגע שנבחר תולעים אסופים, למקם אותם על צלחת חדשה על-ידי העברת בעדינות תרבות מעבר אגר. מניחים את החוט הלהבה כדי להסיר הנותרים תרבות על האיסוף.</li>
</ol> 6. ביצה הכנה <ol><li>במקום כ 20 למבוגרים בעלי חיים (כ 2-3 ימים לאחר הבקיעה כאשר גדל ב- 20 ° C) על ידי איסוף או chunking כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, &#34; Chunking ותולעים איסוף, &#34; על צלחת עם 50 µL של e. coli זן, OP50.</li>
	<li>כדי לאסוף את הביצים, להציף את הצלחת עם 10 מ"ל M9 מאגר לאחר 1-2 ימים. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, מערבולת, בעדינות להתסיס את תוכנו בצלחת אגר לשחרר ביצים תקוע OP50 או חיות למבוגרים. לאסוף את כל הנוזל המכיל ביצים עם מבוגרים.</li>
	צינור <li>M9 להעביר פתרון OP50 לתוך חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל-2,100 g x עבור 2 דק</li>
	<li>האחות כ 9 מ של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר OP50.</li>
	<li>Resuspend בגדר 2 מיליליטר מים סטריליים, 1 מ"ל של אקונומיקה ו 1 מ"ל של 0.25 M NaOH.</li>
	<li>לערבב בעדינות על ידי היפוך עד הרוב (כ 70 אחוז) של בעלי חיים למבוגרים מופיעות lysed; בדרך כלל, ביצים נשארים בעינם במהלך טיפול קצר אקונומיקה זה בגלל המעטפת שלהם. Centrifuge צינור חרוטי ב 990 g x עבור 2 דק</li>
	<li>וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ"ל של מאגר M9.</li>
	<li>Centrifuge את צינור חרוטי 990 g x עבור 2 דק וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות גלולה עם 200 µL מאגר M9. 
	הערה: הכנת ביצה עשויים לדרוש ניסויים מרובים. ביצים עלול להיהרס אם הם נחשפו אקונומיקה יותר מדי זמן. אם לא בוקעות, או להקטין את הריכוז של אקונומיקה בתמיסה או להקטין את משך החשיפה מלבין.</li>
</ol> 7. הגדרת צלחת זיהום <ol><li>לוותר על 3-5 מ של YPD לתוך מבחנה סטרילית ולא לחסן אותו עם מושבה בודדת של קנדידה אלביקנס באמצעות לולאה סטרילי.
	<ol><li>למקם את הצינורית על תוף על כל ההזמנות עבור-16-18 h ב- 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>תווית 1.5 mL microfuge שפופרת אחת להכיל אלביקנס ג, ועוד אחד להכיל OP50. להקליט את המשקל של כל שפופרת ריק.
	<ol><li>500 המקום µL של הלילה אלביקנס ג תרבות לתוך צינור הנקרא אלביקנס ג ו- 1,500 µL של התרבות OP50 לילה (מתוך שלב 3.1) לתוך הצינור הנקרא OP50.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב 16,100 x ג וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטריד.</li>
		<li>מחדש להשעות כל גלולה עם 500 µL של מים סטריליים. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- g x. 16,100</li>
		<li>וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להקליט את המשקל הסופי של צינורות microfuge.</li>
		<li>לקבוע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של הצינורות microfuge לפי המשקל הסופי.</li>
	</ol></li> <li>שימוש במים סטריליים, מחדש להשעות בגדר אלביקנס ג ל 10 מ"ג/מ"ל, בגדר OP50 200 מ ג/מ ל. לגרום זיהום ראשי לערבב על ידי שילוב של µL 10 של פתרון 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, 2.5 µL התרבות OP50, 0.5 µL של תרבות אלביקנס ג ו µL 7 מים סטריליים.
	<ol><li>עבור לוחות בקרה, ליצור שילוב אב על-ידי החלפת הנפח של תרבות אלביקנס ג במים סטריליים. זרע µL 20 של זיהום ערבוב או OP50 פתרון שליטה על גבי הלוחות מרכז של NGM באמצעות micropipette. 
		הערה: תולעים כ-100 נחוצים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית במהלך ניתוח. זה וזמינותו מנוהל בדרך כלל כן. לפיכך, של 3.2 x מיקס זיהום, כמו גם של 3.2 x שליטה פתרון מורכב. תערובות אלה עשויים להיות מעט מעל 3 x המקורי כדי להבטיח כי µL מלא 20 הוא נזרע על כל צלחת, ומאפשר מקום לטעויות. מיקס מאסטר זה נוצר בגלל הלוע של התולעת הוא קטן מדי הזחל הראשונית (L1-L3) לצרוך אלביקנס ג. חשיפה סוכנים תרופתי כגון תהליך הזיקוק ( איור 3B), הסוכן הוא הציג את התערובת זיהום. הריכוז של הסוכן של נקבעת מדעית. לדוגמה, ב- 3B איור, 50 מיקרומטר פלוקונאזול מיוצג, אולם 0, 12.5, 25, 50, 100 מיקרומטר פלוקונאזול היו גם נבדק באמצעות פרוטוקול אותו.</li>
	</ol></li></ol> 8. ניתוח של פנוטיפ מעוותים אזור אנאלי (Dar) ואת וזמינותו להישרדות <ol><li>Visualize פנוטיפ דאר הערה: דאר בצורה הטובה ביותר הוא מדמיין בשלב L3 ומעבר. דאר מציג כמו בליטה קטנה באזור פי הטבעת פוסט של התולעת ( איור 2 א), אשר הופך להיות בולט יותר לאורך זמן.
	<ol><li>אשר אם חיה דאר על-ידי הקשה במהירות את הצלחת על הבמה של המיקרוסקופ לנתיחה; בעלי חיים ללא דאר להזיז לאחור באופן מיידי, בעוד בעלי חיים דאר יהיה עליך לחזור על סבבי הקשה להיפוך הכיוון שלהם, או שהם לא יעשה כן בכלל.</li>
	</ol></li> <li>Assay הישרדות <ol><li>הכנת ביצה מלאה כאמור שמתואר פרוטוקול בשלב 6, &#34; ביצה הכנה &#34;. לספור את הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, לדלל את הפתרון ביצה עם M9 עד ריכוז של 5-6 ביציות בריאות לכל µL מושגת. באמצעות פיפטה של, לוותר על 20 מדגם µL המכיל כ- 30 ביצים על גבי צלחת NGM מוכן, באזור בין התרבות חיידקי לצד צלחת (ביצים, מזון לתולעים, OP50, נמצאים בשני מקומות נפרדים).</li>
		<li>Incubate צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לספור את מספר תולעים מתים מבוגרים וחיים על כל צלחת, כמו גם את המספר של תולעים עם דאר. להקליט את האחוז עם דר.</li>
		<li>לשקול חיה מתה, אם זה אינו מגיב שמצותתים על הראש על ידי חוט אלומיניום או הקשה על הצלחת.</li>
		<li>כל יום להעביר תולעים בוגרות שנותרו על ידי איסוף כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, &#34; Chunking ותולעים איסוף, &#34; על צלחת זיהום או הפקד החדש. בשלב זה, במידת הצורך, לבצע וזמינותו של הישרדות על-ידי מעקב אחר מספר תולעים בשידור חי, מת, חסר כל יום. 
		הערה: assay זו עשויה לפעול במשך שבועיים, החל מהכנת ביצה. בנוסף, הפתרון ביצה צריכה לא לפי ראות עיניך אל התרבות חיידקי, הפתרון עשוי להכיל עקבות של אקונומיקה אשר יכול להרוג את OP50. הפתרון צריך להיות גם לפי ביצים יכול להיות תקוע בין צידי הלוח, אגר כ 0.5 ס מ מהקצה של הצלחת, ראות עיניך. בנוסף, עקב התפשטות מהירה של תולעים, העברת מבוגרים על גבי לוחיות הרישוי הוא קריטי כדי להפריד אותם הצאצאים שלהם.</li>
	</ol></li> <li>לנתח הישרדות <ol><li>לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח עקומת הישרדות (עיין רשימת חומרים).</li>
		<li>השווה הישרדות עקומות בשיטת Grehan-Breslow-Wilcoxon (בהנחה כי הנתונים מכל הזמנים הישרדות המוקדמים מדויקות יותר מאשר מאוחר יותר פעמים, משקל הנתונים בהתאם) כמו גם כלים סטטיסטיים Logrank 45. 
		הערה: כך למשל, ב איור 4B -C, ההישרדות של תולעים מטופלים עם מוטציה אלביקנס ג הוא בהשוואה לאלו שטופלו פקדים פראי-סוג isogenic או complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתן לשנות את שיטות assaying C. elegans זיהום והישרדות לאורך כל החיים חשיפה אלביקנס ג אשר תארנו לבחון פתוגן אחר. נוזלי תרביות של חיידקים או פטריות אחר ייתכן וגם למאכל C. elegans באופן דומה. בנוסף, ייתכן לבדיקה זיהומים טורי על-ידי קודם חשיפת הזחל ל one פתוגן כמתואר ולאחר מכן להעביר את החיות ע...

C. elegans שימש כאורגניזם מודל חזק במשך יותר מ-50 שנה. בשנות השישים, ביולוג בדרום אפריקה סידני ברנר חלוץ השימוש של C. elegans ללמוד פיתוח עצביים, לסלול את הדרך לשושלת ארוכה של מדענים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה תאים של בעלי חיים של נמטודות. זה כולל חתני פרס נובל קרייג מלו, אנדרו פייר עבור העבודה שלהם RNAi1, רוברט הורביץ, ג'ון סלסטון עבודתם על התפתחות האיברים ואפופטוזיס-2,-3,-4, מרטין צ'לפי על עבודתו על חלבון פלואורסצנטי ירוק5. למרות אורגניזם מודל זה שימש באופן מסורתי ללמוד ביולוגיה מולקולרית, התפתחותית, במשך 15 השנים האחרונות, חוקרים החלו להשתמש C. elegans כדי לחקור את הביולוגיה של פתוגנים אנושיים שונים כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus סלמונלה enterica, בסרישיה marcescens6,7,8,9,10. מחקרים אלה חשף כי רבים של המנגנונים המעורבים באינטראקציה פתוגן-האדם נשמרים נמטודות, אלא גם כי ישנם כמה מנגנונים חסינות ייחודיים11,זה אורגניזם מודל12. בטבע, C. elegans נתקל מגוון רחב של איומים מפני פתוגנים בלע להציג באדמה, זה סיפק לחץ סלקטיבי חזקה להתפתח ולפתח לשמור על מערכת חיסונית מולדת מתוחכמת ב שלה לומן מעיים. רבים של גנים המנגנונים המעורבים ההגנה של לומן מעיים הם בניצוחו של אלמנטים והתפאורה מאוד שקיימים גם יונקים גבוהה יותר11,13. C. elegans ולכן מייצג מודל ללמוד פתוגנים מדרכי העיכול כמו סלמונלה enterica14, שיגלה boydii15או ויבריו כולרה16.
כאן אנחנו מדגישים צדדיות יוצא דופן של C. elegans כמחשב מארח דגם ללמוד מדבקים כגון אלביקנס ג. C. elegans כמחשב מארח המודל מאפשר תפוקה גבוהה הקרנה של התקפה אלימה פחות יקר, אורכת זמן רב יותר דגם העכבר, המשמש בדרך כלל ללמוד קנדידה42.
במחקר זה, אנו מראים כי מודל זה ואת וזמינותו להישרדות assosiated אמין ניתן ללמוד מארח מולדת המערכת החיסונית effectors חשוב לנטרל זיהומים, גורמים הפתוגן לנהוג התקפה אלימה, ולא תרופתי תרכובות שיכול. להתערב פתוגנזה. שיטה זו שונה כדי מבחני שתואר לעיל, מספק אמצעים של הלומדים חשיפה חיידק במהלך תקופת החיים של החיה, של הזחל לבגרות, ולא רק לבגרות אל המוות43,44. לסיכום, שלנו, C. elegans - מודל אלביקנס ג הוא כלי רב-תכליתי, עוצמה שניתן להשתמש בהם לא רק ללמוד את היסודות גנטי כי הכונן זיהום וחסינות אלא גם לזהות תרכובות חדשות התערבות טיפולית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

נדגים שיטה באמצעות Caenorhabditis elegans כמחשב מארח דגם ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי. חיידקים הם הציגו באמצעות הדיאטה עושה המעי המיקום העיקרי למחלה. המעי נמטודות מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית מחקה בתרבית של המעיים, שקוף שהופך אותו לבצע מחקר מיקרוסקופיות של קולוניזציה. הנה אנחנו מראים כי פתוגנים יכול לגרום למחלות ומוות. אנו מסוגלים לזהות חיידקים מוטנטים להראות שונה התקפה אלימה. שלה שנשמרת תגובה הטבועה ביוטיים מדגיש גורם C. elegans מערכת מעולה כדי לחקור היבטים של אינטראקציות החיסון מולדים המארח. אנו מראים כי מארחים עם מוטציות בגן אוקסידאז כפול לא יכול להפיק מינים חמצן תגובתי, אינם מסוגלים לעמוד בפני העלבון מיקרוביאלי. נדגים נוסף צדדיות של וזמינותו להישרדות שהוצגו על-ידי הצגת כי זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי צמיחת חיידקים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי לגלות את הגורמים התקפה אלימה פטרייתי כמטרות לפיתוח של סוכני פטריות חדשניים, כמו גם לספק הזדמנות לחשוף עוד יותר אינטראקציות מארח-חיידק. העיצוב של זה וזמינותו משאיל את עצמו היטב כדי תפוקה גבוהה מסכי הגנום כולו, בזמן יכולת הקפאה-שימור תולעים לשימוש עתידי הופכת במודל חיה כל חסכונית ואטרקטיבית, ללמוד.

Assay פתוגנזה (איור 1) באמצעות אלביקנס ג ו- C. elegans בעבר שתואר עד17,שלנו במעבדה18 ו-19,אחרים מעבדות20. נדגים את amenability של השימוש C. elegans ללמוד התקפה אלימה אלביקנס ג מראה כי אלביקנס ג...

Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.2K Views.  Worcester Polytechnic Institute. כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

Video: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...