Name: the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

עבודה זו ביצע, נתמך על ידי המכון הפוליטכני וורצ.

1. הכנה של תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM) <ol><li>עבור 1 L של מדיה, לשלב 20 גרם אגר, מקור חנקן אורגני 2.5 g (למשל, מה נשארתי-peptone) ו- 3 גר' נתרן כלורי בבקבוקון 2 ל'. להוסיף 975 מ ל מים סטריליים.
	<ol><li>הוספה בבר מערבבים סטרילי. אם משתמש של המשפך מדיה אוטומטי, אבובים אוטוקלב ומדיה למשך 15 דקות; המדיה צריך להיות בלוק עבור יותר אם נפח גבוה יותר עשוי.</li>
	</ol></li> <li>להגדיר את המדיה בצלחת מערבבים ולאחר להתקרר.
	<ol><li>לאחר מדיה חם למגע (כ 60 ° C) גילוח ורחיצה כירורגית להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl 2, 25 מ של KPO 4 ו- 1 מ"ל של 0.5% כולסטרול באתנול.</li>
		<li>שופכים מדיה (ידנית או על ידי משאבת אוטומטית) תחת זרימה שכבתית לתוך 35 מ"מ x 10 מ"מ עקר פטרי. אפשר להתייבש תחת מכסה המנוע של 1-2 ימים לפני השימוש. 
		הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C כדי למנוע זיהום.</li>
	</ol></li></ol> 2. ביצוע של תולעת לבחור <ol><li>לחתוך חתיכה 1.5 ס מ של חוט אלומיניום. בזהירות להוסיף כ 0.5 ס מ באורך הזה לתוך קצה פיפטה פסטר.
	<ol><li>באמצעות מבער בונזן או אלכוהול המנורה, להמיס את הטיפ פיפטה מזכוכית ידי סובבים לאיטם זה ב הלהבה עד הכבל הוא מאובטח דבקה הפיפטה מבלי להתפשר על הצורה המקורית של קצה פיפטה.</li>
	</ol></li></ol> 3. הכנה של e. coli תרבות <ol><li>באמצעות לולאה סטרילי, לחסן שמושבה בודדת של e. coli זן OP50 ב 200 מ ל מרק לוריא. דגירה בין לילה ברעידות-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>התרבות נוזלי מוכן לשימוש ביום המחרת, ניתן לאחסן ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש. 
	הערה: המתח e. coli, OP50, משמש כמקור מזון עבור C. elegans. תרבות זו עשוי לשמש עד כמה חודשים כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 4. חיוני C. elegans תחזוקה <ol><li>זרע שהכין NGM פלטות אגר עם e. coli אכון כ 50-100 µL של תרבות נוזלי מוכן OP50 במרכז הצלחת.</li>
	<li>מכסה צלחות, לאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לאחר יבש, במקום צלחות בגיל 37 ° C בלילה לצמיחה מהירה או לשמור בטמפרטורת החדר, אם צמיחה איטית יותר רצוי.</li>
	<li>להוסיף תולעים לצלחת על-ידי &#34; chunking, &#34; (ראה פרוטוקול שלב 5 &#34; Chunking ותולעים איסוף &#34;), אוסף תולעים בנפרד או הצבת ביצי התולעת ישירות לצלחת (ראה פרוטוקול שלב 6 &#34; ביצה הכנה &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking ותולעים איסוף הערה: &#34; Chunking, &#34; מתייחס שיטה אשר נפוץ ב- C. elegans תחזוקה. זה כרוך חיתוך מקטע של צלחת אגר NGM המכיל תולעים, מעביר את החתיכה הזאת על גבי צלחת חדשה, וכך גם העברת כמות גדולה של תולעים בתהליך. הזיהום עשוי גם לגזור את הצלחת באופן זה. כאשר בוחרים תולעים, חשוב לשמור על היושרה של אגר כי תולעים יכולים ללכת לאיבוד בתוך חורים אגר. בנוסף, חשוב לאפשר האיסוף להתקרר, לפני שתיגע הלוח כדי למנוע התכה של אגר. או לשרוף את התולעים.
<ol><li>על מנת להעביר במהירות כמויות גדולות של תולעים על גבי לוחיות הרישוי, לחתוך חתיכה של אגר NGM המכיל את התולעים שנבחר בעזרת מרית. להסיר את החלק הגזור ולמקם אותו הפרצוף למטה בקצה הדשא של OP50 על צלחת חדשה.</li>
	<li>העברת תולעים בנפרד כמתואר להלן פרוטוקול שלב 8.2, &#34; Assay הישרדות, &#34; באמצעות תולעת לבחור. להבה החוט של התולעת לבחור עד שזה אדום. להסיר אותה הלהבה ולאפשר לו להתקרר למשך כמה שניות.</li>
	<li>בעדינות באמצעות הכבל על האיסוף, לגרד את הדשא של התרבות OP50 גדל על הלוח החדש, המכסים את החוט על האיסוף.</li>
	<li>התרבות צמיגה המכסים את קצה החוט גורם תולעים לדבוק קצה האיסוף, ובכך בעדינות להרים תולעים שנבחר באמצעות תנועה swiping.</li>
	<li>ברגע שנבחר תולעים אסופים, למקם אותם על צלחת חדשה על-ידי העברת בעדינות תרבות מעבר אגר. מניחים את החוט הלהבה כדי להסיר הנותרים תרבות על האיסוף.</li>
</ol> 6. ביצה הכנה <ol><li>במקום כ 20 למבוגרים בעלי חיים (כ 2-3 ימים לאחר הבקיעה כאשר גדל ב- 20 ° C) על ידי איסוף או chunking כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, &#34; Chunking ותולעים איסוף, &#34; על צלחת עם 50 µL של e. coli זן, OP50.</li>
	<li>כדי לאסוף את הביצים, להציף את הצלחת עם 10 מ"ל M9 מאגר לאחר 1-2 ימים. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, מערבולת, בעדינות להתסיס את תוכנו בצלחת אגר לשחרר ביצים תקוע OP50 או חיות למבוגרים. לאסוף את כל הנוזל המכיל ביצים עם מבוגרים.</li>
	צינור <li>M9 להעביר פתרון OP50 לתוך חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל-2,100 g x עבור 2 דק</li>
	<li>האחות כ 9 מ של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר OP50.</li>
	<li>Resuspend בגדר 2 מיליליטר מים סטריליים, 1 מ"ל של אקונומיקה ו 1 מ"ל של 0.25 M NaOH.</li>
	<li>לערבב בעדינות על ידי היפוך עד הרוב (כ 70 אחוז) של בעלי חיים למבוגרים מופיעות lysed; בדרך כלל, ביצים נשארים בעינם במהלך טיפול קצר אקונומיקה זה בגלל המעטפת שלהם. Centrifuge צינור חרוטי ב 990 g x עבור 2 דק</li>
	<li>וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ"ל של מאגר M9.</li>
	<li>Centrifuge את צינור חרוטי 990 g x עבור 2 דק וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות גלולה עם 200 µL מאגר M9. 
	הערה: הכנת ביצה עשויים לדרוש ניסויים מרובים. ביצים עלול להיהרס אם הם נחשפו אקונומיקה יותר מדי זמן. אם לא בוקעות, או להקטין את הריכוז של אקונומיקה בתמיסה או להקטין את משך החשיפה מלבין.</li>
</ol> 7. הגדרת צלחת זיהום <ol><li>לוותר על 3-5 מ של YPD לתוך מבחנה סטרילית ולא לחסן אותו עם מושבה בודדת של קנדידה אלביקנס באמצעות לולאה סטרילי.
	<ol><li>למקם את הצינורית על תוף על כל ההזמנות עבור-16-18 h ב- 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>תווית 1.5 mL microfuge שפופרת אחת להכיל אלביקנס ג, ועוד אחד להכיל OP50. להקליט את המשקל של כל שפופרת ריק.
	<ol><li>500 המקום µL של הלילה אלביקנס ג תרבות לתוך צינור הנקרא אלביקנס ג ו- 1,500 µL של התרבות OP50 לילה (מתוך שלב 3.1) לתוך הצינור הנקרא OP50.</li>
		<li>צנטריפוגה 10 דקות ב 16,100 x ג וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטריד.</li>
		<li>מחדש להשעות כל גלולה עם 500 µL של מים סטריליים. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- g x. 16,100</li>
		<li>וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להקליט את המשקל הסופי של צינורות microfuge.</li>
		<li>לקבוע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של הצינורות microfuge לפי המשקל הסופי.</li>
	</ol></li> <li>שימוש במים סטריליים, מחדש להשעות בגדר אלביקנס ג ל 10 מ"ג/מ"ל, בגדר OP50 200 מ ג/מ ל. לגרום זיהום ראשי לערבב על ידי שילוב של µL 10 של פתרון 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, 2.5 µL התרבות OP50, 0.5 µL של תרבות אלביקנס ג ו µL 7 מים סטריליים.
	<ol><li>עבור לוחות בקרה, ליצור שילוב אב על-ידי החלפת הנפח של תרבות אלביקנס ג במים סטריליים. זרע µL 20 של זיהום ערבוב או OP50 פתרון שליטה על גבי הלוחות מרכז של NGM באמצעות micropipette. 
		הערה: תולעים כ-100 נחוצים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית במהלך ניתוח. זה וזמינותו מנוהל בדרך כלל כן. לפיכך, של 3.2 x מיקס זיהום, כמו גם של 3.2 x שליטה פתרון מורכב. תערובות אלה עשויים להיות מעט מעל 3 x המקורי כדי להבטיח כי µL מלא 20 הוא נזרע על כל צלחת, ומאפשר מקום לטעויות. מיקס מאסטר זה נוצר בגלל הלוע של התולעת הוא קטן מדי הזחל הראשונית (L1-L3) לצרוך אלביקנס ג. חשיפה סוכנים תרופתי כגון תהליך הזיקוק ( איור 3B), הסוכן הוא הציג את התערובת זיהום. הריכוז של הסוכן של נקבעת מדעית. לדוגמה, ב- 3B איור, 50 מיקרומטר פלוקונאזול מיוצג, אולם 0, 12.5, 25, 50, 100 מיקרומטר פלוקונאזול היו גם נבדק באמצעות פרוטוקול אותו.</li>
	</ol></li></ol> 8. ניתוח של פנוטיפ מעוותים אזור אנאלי (Dar) ואת וזמינותו להישרדות <ol><li>Visualize פנוטיפ דאר הערה: דאר בצורה הטובה ביותר הוא מדמיין בשלב L3 ומעבר. דאר מציג כמו בליטה קטנה באזור פי הטבעת פוסט של התולעת ( איור 2 א), אשר הופך להיות בולט יותר לאורך זמן.
	<ol><li>אשר אם חיה דאר על-ידי הקשה במהירות את הצלחת על הבמה של המיקרוסקופ לנתיחה; בעלי חיים ללא דאר להזיז לאחור באופן מיידי, בעוד בעלי חיים דאר יהיה עליך לחזור על סבבי הקשה להיפוך הכיוון שלהם, או שהם לא יעשה כן בכלל.</li>
	</ol></li> <li>Assay הישרדות <ol><li>הכנת ביצה מלאה כאמור שמתואר פרוטוקול בשלב 6, &#34; ביצה הכנה &#34;. לספור את הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, לדלל את הפתרון ביצה עם M9 עד ריכוז של 5-6 ביציות בריאות לכל µL מושגת. באמצעות פיפטה של, לוותר על 20 מדגם µL המכיל כ- 30 ביצים על גבי צלחת NGM מוכן, באזור בין התרבות חיידקי לצד צלחת (ביצים, מזון לתולעים, OP50, נמצאים בשני מקומות נפרדים).</li>
		<li>Incubate צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לספור את מספר תולעים מתים מבוגרים וחיים על כל צלחת, כמו גם את המספר של תולעים עם דאר. להקליט את האחוז עם דר.</li>
		<li>לשקול חיה מתה, אם זה אינו מגיב שמצותתים על הראש על ידי חוט אלומיניום או הקשה על הצלחת.</li>
		<li>כל יום להעביר תולעים בוגרות שנותרו על ידי איסוף כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, &#34; Chunking ותולעים איסוף, &#34; על צלחת זיהום או הפקד החדש. בשלב זה, במידת הצורך, לבצע וזמינותו של הישרדות על-ידי מעקב אחר מספר תולעים בשידור חי, מת, חסר כל יום. 
		הערה: assay זו עשויה לפעול במשך שבועיים, החל מהכנת ביצה. בנוסף, הפתרון ביצה צריכה לא לפי ראות עיניך אל התרבות חיידקי, הפתרון עשוי להכיל עקבות של אקונומיקה אשר יכול להרוג את OP50. הפתרון צריך להיות גם לפי ביצים יכול להיות תקוע בין צידי הלוח, אגר כ 0.5 ס מ מהקצה של הצלחת, ראות עיניך. בנוסף, עקב התפשטות מהירה של תולעים, העברת מבוגרים על גבי לוחיות הרישוי הוא קריטי כדי להפריד אותם הצאצאים שלהם.</li>
	</ol></li> <li>לנתח הישרדות <ol><li>לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח עקומת הישרדות (עיין רשימת חומרים).</li>
		<li>השווה הישרדות עקומות בשיטת Grehan-Breslow-Wilcoxon (בהנחה כי הנתונים מכל הזמנים הישרדות המוקדמים מדויקות יותר מאשר מאוחר יותר פעמים, משקל הנתונים בהתאם) כמו גם כלים סטטיסטיים Logrank 45. 
		הערה: כך למשל, ב איור 4B -C, ההישרדות של תולעים מטופלים עם מוטציה אלביקנס ג הוא בהשוואה לאלו שטופלו פקדים פראי-סוג isogenic או complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתן לשנות את שיטות assaying C. elegans זיהום והישרדות לאורך כל החיים חשיפה אלביקנס ג אשר תארנו לבחון פתוגן אחר. נוזלי תרביות של חיידקים או פטריות אחר ייתכן וגם למאכל C. elegans באופן דומה. בנוסף, ייתכן לבדיקה זיהומים טורי על-ידי קודם חשיפת הזחל ל one פתוגן כמתואר ולאחר מכן להעביר את החיות ע...

C. elegans שימש כאורגניזם מודל חזק במשך יותר מ-50 שנה. בשנות השישים, ביולוג בדרום אפריקה סידני ברנר חלוץ השימוש של C. elegans ללמוד פיתוח עצביים, לסלול את הדרך לשושלת ארוכה של מדענים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה תאים של בעלי חיים של נמטודות. זה כולל חתני פרס נובל קרייג מלו, אנדרו פייר עבור העבודה שלהם RNAi1, רוברט הורביץ, ג'ון סלסטון עבודתם על התפתחות האיברים ואפופטוזיס-2,-3,-4, מרטין צ'לפי על עבודתו על חלבון פלואורסצנטי ירוק5. למרות אורגניזם מודל זה שימש באופן מסורתי ללמוד ביולוגיה מולקולרית, התפתחותית, במשך 15 השנים האחרונות, חוקרים החלו להשתמש C. elegans כדי לחקור את הביולוגיה של פתוגנים אנושיים שונים כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus סלמונלה enterica, בסרישיה marcescens6,7,8,9,10. מחקרים אלה חשף כי רבים של המנגנונים המעורבים באינטראקציה פתוגן-האדם נשמרים נמטודות, אלא גם כי ישנם כמה מנגנונים חסינות ייחודיים11,זה אורגניזם מודל12. בטבע, C. elegans נתקל מגוון רחב של איומים מפני פתוגנים בלע להציג באדמה, זה סיפק לחץ סלקטיבי חזקה להתפתח ולפתח לשמור על מערכת חיסונית מולדת מתוחכמת ב שלה לומן מעיים. רבים של גנים המנגנונים המעורבים ההגנה של לומן מעיים הם בניצוחו של אלמנטים והתפאורה מאוד שקיימים גם יונקים גבוהה יותר11,13. C. elegans ולכן מייצג מודל ללמוד פתוגנים מדרכי העיכול כמו סלמונלה enterica14, שיגלה boydii15או ויבריו כולרה16.
כאן אנחנו מדגישים צדדיות יוצא דופן של C. elegans כמחשב מארח דגם ללמוד מדבקים כגון אלביקנס ג. C. elegans כמחשב מארח המודל מאפשר תפוקה גבוהה הקרנה של התקפה אלימה פחות יקר, אורכת זמן רב יותר דגם העכבר, המשמש בדרך כלל ללמוד קנדידה42.
במחקר זה, אנו מראים כי מודל זה ואת וזמינותו להישרדות assosiated אמין ניתן ללמוד מארח מולדת המערכת החיסונית effectors חשוב לנטרל זיהומים, גורמים הפתוגן לנהוג התקפה אלימה, ולא תרופתי תרכובות שיכול. להתערב פתוגנזה. שיטה זו שונה כדי מבחני שתואר לעיל, מספק אמצעים של הלומדים חשיפה חיידק במהלך תקופת החיים של החיה, של הזחל לבגרות, ולא רק לבגרות אל המוות43,44. לסיכום, שלנו, C. elegans - מודל אלביקנס ג הוא כלי רב-תכליתי, עוצמה שניתן להשתמש בהם לא רק ללמוד את היסודות גנטי כי הכונן זיהום וחסינות אלא גם לזהות תרכובות חדשות התערבות טיפולית.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

נדגים שיטה באמצעות Caenorhabditis elegans כמחשב מארח דגם ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי. חיידקים הם הציגו באמצעות הדיאטה עושה המעי המיקום העיקרי למחלה. המעי נמטודות מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית מחקה בתרבית של המעיים, שקוף שהופך אותו לבצע מחקר מיקרוסקופיות של קולוניזציה. הנה אנחנו מראים כי פתוגנים יכול לגרום למחלות ומוות. אנו מסוגלים לזהות חיידקים מוטנטים להראות שונה התקפה אלימה. שלה שנשמרת תגובה הטבועה ביוטיים מדגיש גורם C. elegans מערכת מעולה כדי לחקור היבטים של אינטראקציות החיסון מולדים המארח. אנו מראים כי מארחים עם מוטציות בגן אוקסידאז כפול לא יכול להפיק מינים חמצן תגובתי, אינם מסוגלים לעמוד בפני העלבון מיקרוביאלי. נדגים נוסף צדדיות של וזמינותו להישרדות שהוצגו על-ידי הצגת כי זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי צמיחת חיידקים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי לגלות את הגורמים התקפה אלימה פטרייתי כמטרות לפיתוח של סוכני פטריות חדשניים, כמו גם לספק הזדמנות לחשוף עוד יותר אינטראקציות מארח-חיידק. העיצוב של זה וזמינותו משאיל את עצמו היטב כדי תפוקה גבוהה מסכי הגנום כולו, בזמן יכולת הקפאה-שימור תולעים לשימוש עתידי הופכת במודל חיה כל חסכונית ואטרקטיבית, ללמוד.

Assay פתוגנזה (איור 1) באמצעות אלביקנס ג ו- C. elegans בעבר שתואר עד17,שלנו במעבדה18 ו-19,אחרים מעבדות20. נדגים את amenability של השימוש C. elegans ללמוד התקפה אלימה אלביקנס ג מראה כי אלביקנס ג...

Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K Views.  Worcester Polytechnic Institute. כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

Video: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Immunology and Infection

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their gut microbiomes. While experiments with well-characterized bacteria or defined bacterial communities can facilitate the analysis of molecular mechanisms, studying nematodes in their natural microbial context is essential for exploring the diversity of such mechanisms. At the same time, the isolation of worms from the wild is not always feasible, and, even when possible, sampling from the wild restricts the use of the genetic toolkit otherwise available for C. elegans research. The following protocol describes a method for microbiome studies utilizing compost microcosms for the in-lab&#160;growth in microbially diverse and natural-like environments.
Locally sourced soil can be enriched with produce to diversify the microbial communities in which worms are raised and from which they are harvested, washed, and surface-sterilized for subsequent analyses. Representative experiments demonstrate the ability to modulate the microbial community in a common soil by enriching it with different produce and further demonstrate that worms raised in these distinct environments assemble similar gut microbiomes distinct from their respective environments, supporting the notion of a species-specific core gut microbiome. Overall, compost microcosms provide natural-like in-lab environments for microbiome research as an alternative to synthetic microbial communities or to the isolation of wild nematodes.

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

Compost microcosms bring the microbial diversity found in nature into the laboratory to facilitate microbiome research in Caenorhabditis elegans. Provided here are protocols for setting up microcosm experiments, with the experiments demonstrating the ability to modulate environmental microbial diversity to explore the relationships between environmental microbial diversity and worm gut microbiome composition.

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their ...

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

לומד קהילות חיידקים

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

שימוש בנתונים של תולעת בודדת כדי לכמת את ההטרוגניות באינטראקציות של Caenorhabditis elegans-Bacterial

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans