وكان هذا العمل المنجز في ويدعمها معهد البوليتكنيك ورسيستر.

1-التحضير لديدان أسطوانية النمو المتوسطة (NGM) <ol><li>ل 1 لتر من وسائط الإعلام، والجمع بين أجار 20 غ ومصدر النيتروجين العضوي 2.5 g (مثلاً، باكتو-ببتون) وكلوريد الصوديوم الجيل الثالث 3g في قارورة 2 ل. إضافة 975 مل الماء المعقم.
	<ol><li>إضافة في حانة ضجة عقيمة. في حالة استخدام الوسائط التلقائية برير، وأنابيب اﻷوتوكﻻف ووسائط الإعلام لمدة 15 دقيقة؛ ينبغي أن تكون وسائل الإعلام يعقم لفترة أطول إذا تم زيادة حجم-</li>
	</ol></li> <li>تعيين وسائط الإعلام على لوحة إثارة، والسماح لتبرد.
	<ol><li>بمجرد وسائل الإعلام الحارة للمس (حوالي 60 درجة مئوية) أسيبتيكالي إضافة 1 مل من 1 م MgSO 4 &#9679; ح 2 س 1 مل كاكل 1 م 2، 25 مل من مشرف 4 و 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم 0.5% في الإيثانول-</li>
		<li>صب وسائط الإعلام (باليد أو بمضخة التلقائي) تحت الاندفاق الصفحي في 35 مم × 10 مم أطباق بتري معقمة. السماح لتجف تحت غطاء لمدة 1-2 أيام قبل الاستخدام. 
		ملاحظة: يجب تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمنع التلوث.</li>
	</ol></li></ol> 2. مما يجعل "اختيار دودة" <ol><li>قطع قطعة 1.5 سم من أسلاك الألومنيوم. عناية إدراج حوالي 0.5 سم طول هذا غيض من ماصة باستور.
	<ol><li>باستخدام موقد بنسن أو مصباح الكحول، تذوب نصيحة ماصة زجاجية بالتناوب ببطء في اللهب حتى الأسلاك بشكل أمن التقيد الماصة، دون المساس بالشكل الأصلي من طرف ماصة.</li>
	</ol></li></ol> 3. إعداد الثقافة كولاي <ol><li>باستخدام حلقة عقيمة، تطعيم مستعمرة واحدة من سلالة كولاي OP50 في 200 مل من "مرق لوريا". تبني بين عشية وضحاها مع الهز في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ثقافة السائل جاهز للاستخدام وفي اليوم التالي وقد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. 
	ملاحظة: يستخدم كمصدر لغذاء لسلالة كولاي، OP50، C. ايليجانس. ويمكن استخدام هذه الثقافة لتصل إلى عدة أشهر عند تخزينها في 4 ° C.</li>
</ol> 4. أساسي صيانة C. ايليجانس <ol><li>البذور التي أعدتها اكتشاف حوالي 50-100 ميليلتر استعداد الثقافة السائل OP50 في وسط اللوحة NGM أجار لوحات مع كولاي.</li>
	تغطي لوحات <li>والسماح لهم جاف في درجة حرارة الغرفة ح 24. بمجرد جفاف، وضع لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للنمو السريع أو تبقى في درجة حرارة الغرفة، إذا كان المطلوب هو نمو أبطأ.</li>
	<li>إضافة الديدان إلى اللوحة أما عن طريق &#34; chunking، &#34; (راجع الخطوة 5 من بروتوكول &#34; Chunking والديدان الانتقاء &#34;)، والتقاط الديدان منفردة، أو وضع بيض دودة مباشرة على اللوحة (راجع الخطوة 6 من بروتوكول &#34; "إعداد البيض" &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking والديدان الانتقاء ملاحظة: &#34; Chunking، &#34; يشير إلى ممارسة شائعة في صيانة C. ايليجانس. وهذا ينطوي على قطع مقطع من لوحة أجار NGM يحتوي على الديدان، ونقل هذه القطعة على لوحة جديدة، وهكذا أيضا نقل عدد كبير من الديدان في هذه العملية. كما قد يكون قطع التلوث خارج اللوحة بهذه الطريقة. عند اختيار الديدان، من المهم الحفاظ على سلامة أجار سبب الديدان يمكن أن تضيع في الثقوب في أجار. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم السماح لانتقاء لتبرد قبل لمس لوحة لمنع ذوبان في أجار أو حرق الديدان.
<ol><li>من أجل سرعة نقل كميات كبيرة من الديدان على لوحات جديدة، قطع قطعة من أجار NGM يحتوي على الديدان المحدد باستخدام ملعقة. إزالة قطعة قطعة ووضعه الوجه لأسفل على حافة حديقة OP50 على لوحة جديدة.</li>
	<li>نقل الديدان على حدة كما هو موضح أدناه في البروتوكول خطوة 8.2، &#34; "بقاء المقايسة"، &#34; استخدام دودة بيك. لهب الأسلاك في انتقاء دودة حتى يصبح أحمر. إزالته من اللهب، والسماح لها لتبرد لبضع ثوان.</li>
	<li>باستخدام الأسلاك على الانتقاء، بلطف كشط الحديقة لثقافة OP50 نمت على لوحة جديدة، تغطي الأسلاك في الانتقاء.</li>
	<li>ثقافة لزج تغطي غيض السلك يجعل الديدان عصا غيض الانتقاء، وهكذا بلطف التقاط الديدان المحدد باستخدام اقتراحا بالضرب-</li>
	<li>مرة واحدة جمعت الديدان مختارة، وضعها على لوحة جديدة بالضرب بلطف الثقافة عبر أجار. وضع الأسلاك في الشعلة لإزالة ثقافة المتبقية في الانتقاء.</li>
</ol> 6. بيضة التحضير <ol><li>بوضع حوالي 20 الحيوانات الكبار (حوالي 2-3 أيام بعد الفقس عندما تزرع في 20 درجة مئوية) أما الانتقاء أو chunking كما هو موضح في الخطوة 5، من البروتوكول &#34; Chunking والديدان الانتقاء، &#34; على طبق من ذهب المصنف مع 50 ميليلتر سلالة كولاي، OP50-</li>
	<li>لجمع البيض، والفيضانات اللوحة مع 10 مل من المخزن المؤقت M9 بعد 1-2 يوم. استخدام ماصة مصلية زجاج، دوامة وتحرض بلطف المحتويات على لوحة أجار للإفراج عن البيض تمسك OP50 أو الحيوانات الكبار. جمع جميع السائل الذي يحتوي على البيض والكبار-</li>
	أنبوب <li>الحل نقل M9 و OP50 إلى 15 مل مخروطية الشكل. الطرد المركزي 15 مل الأنبوبة المخروطية في 2,100 س ز للحد الأدنى 2</li>
	<li>نضح حوالي 9 مل من المادة طافية دون إزعاج بيليه OP50.</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه في 2 مل الماء المعقم ومل 1 من التبييض 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم M 0.25.</li>
	<li>المزيج بلطف بعكس حتى يبدو أن غالبية (نحو 70 في المائة) من الحيوانات الكبار ليسيد؛ عادة، البيض تبقى سليمة خلال هذا العلاج التبييض قصيرة بسبب قذيفة بهم. الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية في 990 س ز للحد الأدنى 2</li>
	<li>المادة طافية aspirate دون إزعاج بيليه. إعادة تعليق بيليه في 10 مل من المخزن المؤقت M9.</li>
	<li>الطرد المركزي الأنبوبة المخروطية في 990 س ز للمادة 2 دقيقة Aspirate طافية دون بيليه مثيرة للقلق. تعليق إعادة بيليه مع 200 ميليلتر من المخزن المؤقت M9. 
	ملاحظة: قد يتطلب إعداد البيض عدة محاكمات. وقد دمرت البيض إذا تعرضوا للتبييض لفترة طويلة جداً. إذا لم يفقس البيض، أما انخفاض تركيز التبييض في حل أو تقليل مدة التعرض للتبييض.</li>
</ol> 7. إنشاء لوحة العدوى <ol><li>الاستغناء عن 3-5 مل YPD في أنبوب اختبار عقيمة وتطعيم ذلك مع مستعمرة واحدة من المبيضات البيض استخدام حلقة عقيمة.
	<ol><li>وضع الأنبوب على طبل الدنمارك لما يقرب من 16-18 ح في 30 درجة مئوية.</li>
	</ol></li> <li>واحد تسمية 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب تحتوي على المبيضة، وأخرى تحتوي على OP50. تسجيل وزن كل أنبوبة فارغة.
	<ol><li>ميليلتر 500 مكان للمبيت الثقافة المبيضة في أنبوب المسمى المبيضة وميليلتر 1,500 ثقافة OP50 بين عشية وضحاها (من الخطوة 3.1) إلى الأنبوبة المسماة OP50.</li>
		<li>الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 16,100 س المادة زاي Aspirate طافية دون بيليه المزعجة.</li>
		<li>إعادة تعليق كل بيليه مع 500 ميليلتر من الماء المعقم. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 16,100 غ. س</li>
		<li>المادة طافية aspirate دون إزعاج بيليه. تسجيل الوزن النهائي [ميكروفوج] أنابيب-</li>
		<li>تحديد وزن كل بيليه بطرح وزن الأولى [ميكروفوج] أنابيب من الوزن النهائي.</li>
	</ol></li> <li>باستخدام الماء المعقم، تعليق إعادة بيليه المبيضة إلى 10 ملغ/مل، وبيليه OP50 إلى 200 ملغ/مل. جعل عدوى رئيسي مزيج من خلال الجمع بين 10 ميليلتر من حل 50 ملغ/مل من ستربتوميسين، 2.5 ميليلتر لثقافة OP50، 0.5 ميليلتر للثقافة المبيضة و 7 ميليلتر من الماء المعقم.
	<ol><li>على لوحات التحكم، وخلق مزيج رئيسي بالاستعاضة عن حجم الثقافة المبيضة بالماء المعقم. البذور 20 ميليلتر ميكس العدوى أو حل OP50 السيطرة على لوحات مركز NGM باستخدام ميكروبيبيتي. 
		ملاحظة: الديدان حوالي 100 مطلوبة لتحديد الدلالة الإحصائية أثناء التحليل. عادة ما يتم تشغيل هذا الفحص في ثلاث نسخ. وهكذا، يرصد من 3.2 x ميكس العدوى وكذلك 3.2 x حل السيطرة. يمزج هذه مصنوعة لتكون يزيد قليلاً عن 3 × الأصلي لضمان أن ميليلتر الكامل 20 هو المصنف على كل لوحة، مما يتيح مجالاً للخطأ. يتم إنشاء هذا المزيج الرئيسي لأن البلعوم الدودة صغيرة جداً خلال المراحل الأولية اليرقات (L1 L3) تستهلك المبيضة. للتعرض للعوامل الدوائية مثل الفلوكونازول ( الشكل 3B)، هو عرض الوكيل إلى خليط العدوى. ويتحدد تجريبيا تركيز عامل. على سبيل المثال، في الشكل 3B، 50 ميكرومتر ويمثل الفلوكونازول، بيد أن 0 و 12.5، 25، 50 و 100 ميكرومتر الفلوكونازول كانت أيضا اختبار باستخدام البروتوكول نفسه.</li>
	</ol></li></ol> 8. تحليل النمط الظاهري "مشوه المنطقة الشرجية" (دار) والبقاء على قيد الحياة بالانزيم <ol><li>تصور النمط الظاهري دار ملاحظة: دار هو تصور أفضل في مرحلة المستوى 3 وما بعدها. دار يعرض نتوء صغير في منطقة الشرج وظيفة الدودة ( الشكل 2A)، الذي يصبح أكثر وضوحاً مع مرور الوقت.
	<ol><li>تأكيد إذا كان حيوان قد دار بسرعة النقر على اللوحة في مرحلة مجهر تشريح؛ والحيوانات دون إرادة دار الانتقال على الفور إلى الوراء، بينما الحيوانات مع دار سوف تحتاج أما تكرار جولات التنصت عكس اتجاهها، أو أنهم لن تفعل ذلك على الإطلاق-</li>
	</ol></li> <li>البقاء على قيد الحياة بالانزيم <ol><li>إعداد البيض كاملة كما سبق ذكره في البروتوكول الخطوة 6، &#34; "إعداد البيض" &#34;. عد البيض ضمن نطاق التشريح، وتمييع الحل البيض مع M9 حتى يتحقق بتركيز حوالي 5-6 بيضة صحية في ميليلتر. استخدام ماصة، الاستغناء عن 20 ميليلتر عينة تحتوي على حوالي 30 البيض على استعداد NGM لوح، في المنطقة الواقعة بين ثقافة البكتيرية والجانب من لوحة (البيض والأغذية دودة، OP50، في المكانين متميزة)-</li>
		<li>لوحات إينكوباتي في 20 درجة مئوية ح 48. تحت مجهر تشريح، عد عدد الديدان الحية وقتل الكبار في كل لوحة، وكذلك العدد من الديدان مع دار. سجل المئة مع دار.</li>
		<li>النظر في حيوان الميت إذا لم يستجب يجري استغلالها على رأسه بأسلاك الألومنيوم أو التنصت على اللوحة-</li>
		<li>كل يوم، نقل الديدان الكبار المتبقية بالانتقاء كما هو موضح في الخطوة 5، من البروتوكول &#34; Chunking والديدان الانتقاء، &#34; على لوحة العدوى أو عنصر التحكم جديد. عند هذه النقطة، إذا لزم الأمر، القيام مقايسة البقاء على قيد الحياة بتعقب عدد الديدان حية والقتلى والمفقودين كل يوم- 
		ملاحظة: قد يعمل هذا التحليل لمدة أسبوعين، ابتداء من إعداد البيض. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن الاستغناء الحل البيض على ثقافة البكتيرية، كما أن الحل قد تحتوي على آثار التبييض التي يمكن أن تقتل في OP50. كما ينبغي أن يكون الحل الاستغناء عن حوالي 0.5 سم بعيداً عن حافة اللوحة، كما أن البيض يمكن أن تصبح عالقاً بين جانبي اللوحة واجار. بالإضافة إلى ذلك، نظراً للانتشار السريع للديدان، نقل الكبار على لوحات جديدة أمر بالغ الأهمية لفصلها عن ذريتهم.</li>
	</ol></li> <li>بقاء تحليل <ol><li>تحليل النتائج باستخدام برمجيات تحليل منحنى البقاء على قيد الحياة (الرجوع إلى قائمة المواد)-</li>
		<li>بقاء مقارنة منحنيات باستخدام الأسلوب Grehan-بريسلو-الرتبي (مع افتراض أن البيانات من أوقات مبكرة من البقاء على قيد الحياة أكثر دقة من أوقات لاحقة، وزن البيانات تبعاً لذلك) فضلا عن الأدوات الإحصائية لوجرانك 45- 
		ملاحظة: على سبيل المثال، في الشكل 4 باء -ج، بقاء الديدان تعامل مع المسخ المبيضة هو مقارنة بتلك التي تعامل مع عناصر التحكم البرية من نوع اسوي أو كومبليمينتاريستراينس-</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يمكن تعديل طرق المعايرة C. ايليجانس العدوى والبقاء على قيد الحياة على مدى التعرض مدى الحياة المبيضة التي وصفناها لاختبار آخر الممرض. قد السائل ثقافات أخرى من البكتيريا أو الفطريات وتتغذى على C. ايليجانس بطريقة مماثلة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون جزيئي التهابات المسلسل بتعريض ا...

C. ايليجانس قد استخدمت ككائن نموذج قوية لأكثر من 50 عاماً. وفي الستينات، رائدة الأحياء جنوب أفريقيا سيدني برينر استخدام C. ايليجانس لدراسة تطوير الخلايا العصبية، يمهد الطريق لنسب طويلة من العلماء لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلية والحيوان في الديدان الخيطية. وتشمل هذه النسب الحائزين على جائزة نوبل كريغ ميلو وأندرو النار على العمل [رني]1وروبرت هورفيتز وجون سالستون للعمل على تطوير الجهاز والمبرمج2،،من34، ومارتن تشالفي لعمله على بروتين فلوري أخضر5. على الرغم من أن هذا الكائن الحي النموذجي قد استخدمت تقليديا لدراسة البيولوجيا الجزيئية والإنمائية، على مدى السنوات ال 15 الماضية، بدأ الباحثون استخدام C. ايليجانس للتحقيق بيولوجيا مختلف مسببات الأمراض البشرية بما في ذلك Pseudomonas الزّنجاريّة، انتيريكا السالمونيلا، المكوّرات العنقودية الذهبيةو marcescens السراتية6،،من78،9،10. وكشفت هذه الدراسات أن العديد من الآليات التي تشارك في التفاعل الإنسان-الممرض هي المحافظة في الديدان الخيطية، ولكن أيضا أن هناك بعض آليات الحصانة التي فريدة من نوعها لهذا النموذج الحي11،12. في الطبيعة، C. ايليجانس لقاءات مجموعة متنوعة من التهديدات من مسببات الأمراض المستهلكة الموجودة في التربة، ووفر هذا ضغط انتقائي قوية في التطور والحفاظ على نظام المناعة فطرية متطورة في التجويف المعوي،. العديد من الجينات والآليات التي تشارك في حماية التجويف المعوي هي مدبرة من قبل العناصر المحافظة جداً التي توجد أيضا في11،الثدييات العليا13. ولذلك يمثل C. ايليجانس نموذج عظيم لدراسة مسببات الأمراض المعدية المعوية مثل السالمونيلا انتيريكا14أو15من بويديي دوسنتاريا ضمه الكوليرا16.
هنا نسلط الضوء على براعة ملحوظة في C. ايليجانس كمضيف نموذج لدراسة العوامل المعدية مثل المبيضة. C. ايليجانس كمضيف نموذج يسمح لفحص إنتاجية عالية لضراوة التي أقل تكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً من نموذج الفأر، الذي يستخدم عادة لدراسة داء المبيضات42.
في هذه الدراسة، تبين لنا أن هذا النموذج ومقايسة البقاء على قيد الحياة أسوسياتيد يمكن موثوق بها لدراسة المضيف المستجيبة المناعة الفطرية الهامة لمكافحة العدوى، والمحددات الخاصة بالعوامل الممرضة التي تدفع بضراوة، والمركبات الدوائية التي يمكن أن أن تتدخل في نشوء المرض. تختلف عن الاختبارات الموصوفة سابقا، هذا الأسلوب يوفر وسيلة لدراسة التعرض للعوامل الممرضة على مدى فترة عمر الحيوان، من مرحلة اليرقات إلى مرحلة البلوغ، بدلاً من فقط سن البلوغ إلى وفاة43،44. وباختصار، لدينا C. ايليجانس -نموذج المبيضة هو أداة قوية وتنوعاً التي يمكن استخدامها ليس فقط لدراسة الأسس الوراثية التي تقود العدوى والحصانة ولكن أيضا لتحديد مركبات جديدة للتدخل العلاجي.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

علينا أن نظهر أسلوب استخدام ايليجانس كاينورهابديتيس كمضيف نموذج لدراسة التفاعل الميكروبية. ويتم إدخال الميكروبات عن طريق النظام الغذائي يجعل الأمعاء الموقع الرئيسي للمرض. الأمعاء السلكية هيكلياً ووظيفيا يقلد أمعاء الثدييات وهو شفاف يجعلها قابلة للدراسة المجهرية للاستعمار. هنا نظهر أن مسببات الأمراض يمكن أن تسبب المرض والموت. نحن قادرون على تحديد طفرات الميكروبية التي تظهر ضراوة غيرت. يجعل استجابتها الفطرية المصانة الإجهادات الأحيائية C. ايليجانس نظاما ممتازا للتحقيق في أوجه التفاعلات المناعية الفطرية المضيف. نظهر أن تستضيف مع الطفرات في الجين أوكسيديز المزدوج لا يمكن أن تنتج الأنواع الأكسجين التفاعلية وغير قادر على مقاومة الميكروبات إهانة. كذلك ندلل على براعة المقايسة بقاء قدم بإظهار أنه يمكن استخدامه لدراسة تأثيرات مثبطات لنمو الميكروبات. كما يمكن استخدام هذا الفحص اكتشاف عوامل الفوعة الفطرية كأهداف لتطوير العوامل المضادة للفطور الرواية، فضلا عن إتاحة فرصة لمواصلة الكشف عن التفاعلات بين الميكروبات والمضيف. تصميم هذا التحليل يفسح المجال أيضا لإنتاجية عالية شاشات كل الجينوم، بينما القدرة على الديدان cryo-المحافظة لاستخدامها في المستقبل يجعل من نموذج حيوان كله جذابة وفعالة من حيث التكلفة لدراسة.

قد سبق وصف المرضية مقايسة (الشكل 1) استخدام المبيضة و C. ايليجانس لدينا مختبر17،18 و19،مختبرات أخرى20. نبدي الانقياد لاستخدام C. ايليجانس لدراسة الفوعة المبيضة تبين أن الخلايا ...

Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K Views.  Worcester Polytechnic Institute. نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

Video: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>فحصان للعدوى لدراسة الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة في المطثية البيضاء باستخدام المطثية العلبة

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

فحصان للعدوى لدراسة الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة في المطثية البيضاء باستخدام المطثية العلبة

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunology and Infection

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

تقييم الفوعة والمرضية للعدوى أيروموناس في نموذج ايليجانس كاينورهابديتيس

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

التنظيف الانتقائي للنيماتودا Caenorhabditis البرية لإثراء لبكتيريا الميكروبيوم المعوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Biology

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

عزل وتوصيف الجراثيم الطبيعية للنموذج الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

فحصان للعدوى لدراسة الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة في المطثية البيضاء باستخدام المطثية العلبة

فحصان للعدوى لدراسة الأنماط الظاهرية للضراوة غير المميتة في المطثية البيضاء باستخدام المطثية العلبة

الفصل الآلي لل

تقييم الفوعة والمرضية للعدوى أيروموناس في نموذج ايليجانس كاينورهابديتيس

التنظيف الانتقائي للنيماتودا Caenorhabditis البرية لإثراء لبكتيريا الميكروبيوم المعوية

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

عزل وتوصيف الجراثيم الطبيعية للنموذج الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans