Este trabalho foi realizado no e apoiado pelo Instituto Politécnico de Worcester.

1. preparação de nematódeo crescimento médio (NGM) <ol><li>para 1 L de mídia, combinar agar 20g, fonte de nitrogênio orgânico de 2,5 g (por exemplo, bacto peptona) e 3 g de cloreto de sódio em um frasco de 2 L. 975 ml de água estéril.
	<ol><li>Adicionar em uma barra de agitação estéril. Se usando um dosador automático de mídia, tubulação de autoclave e mídia por 15 min; mídia deve ser autoclavada para mais se for feito um maior volume.</li>
	</ol></li> <li>Conjunto de mídia na placa de agitação e deixe arrefecer.
	<ol><li>Uma vez que a mídia está quente ao toque (aproximadamente 60 ° C) em condições de esterilidade, adicione 1 mL de 1m MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL de 1 M CaCl 2, 25ml de KPO 4 e 1 mL de colesterol de 0,5% em etanol.</li>
		<li>Despeje mídia (manualmente ou por bomba automática) sob fluxo laminar em 35 x 10 mm pratos de petri estéril. Deixe para secar sob o capô, por 1-2 dias antes do uso. 
		Nota: As placas devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar a contaminação.</li>
	</ol></li></ol> 2. Fazendo um Worm Pick <ol><li>corte um pedaço de 1,5 cm de fio de alumínio. Introduza cuidadosamente cerca de 0,5 cm de comprimento na ponta de uma pipeta Pasteur.
	<ol><li>Usando um bico de Bunsen ou lâmpada de álcool, derreter a ponta da pipeta de vidro, lentamente, girando-o na chama até que o fio é firmemente aderido a pipeta, sem comprometer a forma original da ponta da pipeta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparação da cultura de e. coli <ol><li>utilizando uma ansa estéril, inocular a colônia única da estirpe de Escherichia coli OP50 em 200 mL de caldo de Luria. Incubar durante uma noite com tremor em 37 ° C.</li>
	<li>a cultura do líquido está pronta para o uso no dia seguinte e podem ser armazenada a 4 ° C, quando não estiver em uso. 
	Nota: A cepa de Escherichia coli, OP50, é usada como fonte de alimento para c. elegans. Esta cultura pode ser utilizada para até vários meses, quando armazenado a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Essencial manutenção de c. elegans <ol><li>semente preparado placas de ágar NGM com e. coli manchando aproximadamente 50-100 µ l de cultura líquida de OP50 preparada no centro da placa.</li>
	<li>Placas de cobre e deixe-os secar à temperatura ambiente por 24 h. Depois de seco, coloque as placas a 37 ° C durante a noite para crescimento rápido ou manter à temperatura ambiente, se for desejado crescimento mais lento.</li>
	<li>Adicionar minhocas à placa por qualquer &#34; a fragmentação, &#34; (ver protocolo passo 5 &#34; Chunking e pegando vermes &#34;), pegar vermes individualmente ou colocação worm ovos diretamente sobre a placa (ver protocolo passo 6 &#34; ovo preparação &#34;).</li>
</ol> 5. CHUNKING e pegando vermes Nota: &#34; Chunking, &#34; refere-se a uma prática que é comum em manutenção de c. elegans. Isto envolve cortar uma secção da placa de ágar de NGM que contém vermes e transferir esta peça em um prato novo, assim também transferência de grande quantidade de vermes no processo. Contaminação também pode ser cortada da placa dessa maneira. Ao escolher os vermes, é importante manter a integridade do ágar, pois vermes podem ser perdidos em buracos de agar. Além disso, é importante para permitir que o escolhido para esfriar antes de tocar no prato para evitar derretimento o ágar ou queimando os vermes.
<ol><li>Para transferir rapidamente grandes quantidades de vermes nas novas chapas, corte um pedaço de ágar NGM contendo os sem-fins selecionados usando uma espátula. Retire o pedaço e coloque a cara no chão à beira do gramado de OP50 num prato novo.</li>
	<li>Transferência individualmente conforme descrito abaixo, na etapa de protocolo 8.2, vermes &#34; ensaio de sobrevivência, &#34; usando um verme escolher. Chama o fio no worm escolher até o vermelho. Removê-lo da chama e deixe-a esfriar por alguns segundos.</li>
	<li>Usando o fio sobre a palheta, lixe ligeiramente o gramado da cultura OP50 crescido na placa nova, cobrindo o fio sobre o pick.</li>
	<li>a cultura viscosa cobrindo a ponta do fio faz vermes furar a ponta da palheta, assim suavemente pegar vermes selecionados usando um movimento percorrendo.</li>
	<li>Uma vez selecionados vermes reunidos, colocá-los em um prato novo swiping suavemente a cultura através de agar. Coloque o fio na chama para remover o restante cultura sobre o pick.</li>
</ol> 6. Preparação de ovos <ol><li>Coloque aproximadamente 20 animais adultos (aproximadamente 2-3 dias após a eclosão, quando cultivada a 20 ° C) por escolher ou fragmentação conforme descrito na etapa de protocolo 5, &#34; Chunking e escolhendo Worms, &#34; em um prato, inoculado com 50 µ L da estirpe de Escherichia coli, OP50.</li>
	<li>Para recolher os ovos, inundar a placa com 10 mL de tampão de M9 após 1-2 dias. Usando uma pipeta sorológica de vidro, agite e agite suavemente o conteúdo na placa de ágar para liberar ovos presos OP50 ou animais adultos. Recolher todo o líquido contendo os ovos e adultos.</li>
	<li>Transferência M9 e OP50 solução em um 15ml cónico tubo. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 2.100 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspire aproximadamente 9 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento OP50.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 2 mL de água estéril, 1 mL de água sanitária e 1 mL de NaOH 0,25 de M.</li>
	<li>Misture suavemente por inversão, até que a maioria (aproximadamente 70 por cento) dos animais adultos aparece lisada; normalmente, ovos permanecem intactos durante este tratamento de lixívia curto por causa de seu escudo. Centrifugar o tubo cônico a 990 x g por 2 min.</li>
	<li>Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender o pellet em 10 mL de tampão de M9.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico em 990 x g por 2 min. aspirado sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com 200 µ l de tampão de M9. 
	Nota: A preparação do ovo pode exigir vários ensaios. Os ovos podem ser destruídos se eles são expostos para branquear por muito tempo. Se os ovos não eclodem, diminuir a concentração de água sanitária em solução ou diminuir a duração da exposição para branquear.</li>
</ol> 7. Configuração de placa de infecção <ol><li>dispensar 3-5 mL de YPD num tubo de ensaio estéril e inoculá-lo com uma única colônia de Candida albicans utilizando uma ansa estéril.
	<ol><li>Colocar o tubo sobre um tambor rotatórios para aproximadamente 16-18 h em 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Rótulo um 1,5 mL microcentrífuga tubo para conter a c. albicans e outra para conter OP50. Registrar o peso de cada tubo vazio.
	<ol><li>Lugar 500 µ l de noite cultura de c. albicans em tubo rotulado de c. albicans e 1.500 µ l da cultura OP50 durante a noite (a partir de passo 3.1) no tubo rotulado OP50.</li>
		<li>Centrifugar durante 10 minutos a 16.100 x sobrenadante de g. aspirado sem sedimento perturbador.</li>
		<li>Re-suspender cada pellet com 500 µ l de água estéril. Centrifugar durante 5 min à 16.100 g. x</li>
		<li>Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Gravar o peso final dos tubos de microcentrífuga.</li>
		<li>Determinar o peso de cada pellet subtraindo o peso inicial dos tubos de microcentrífuga do peso final.</li>
	</ol></li> <li>Usando água estéril, Ressuspender o sedimento de c. albicans a 10 mg/mL e a pelota OP50 a 200 mg/mL. Fazer uma infecção mestre mix pela combinação de 7 µ l de água estéril, 2,5 µ l de OP50 cultura, 0,5 µ l de cultura de c. albicans e 10 µ l de uma solução de 50 mg/mL de estreptomicina.
	<ol><li>Para placas de controle, criar uma mistura de mestre, substituindo o volume da cultura de c. albicans com água estéril. Sementes de 20 µ l de mistura de infecção ou solução de controle OP50 nas chapas de centro de NGM usando uma micropipeta. 
		Nota: Aproximadamente 100 minhocas são necessários para determinar a significância estatística durante a análise. Este ensaio é executado normalmente em triplicado. Assim, feita uma 3.2 x mistura de infecção, bem como um 3.2 x solução de controle. Estas misturas são feitas para serem ligeiramente mais de 3 x o original para garantir que um total de 20 µ l é semeada em cada prato, permitindo espaço para erros. Esta mistura de mestre é criada porque a faringe do worm é muito pequena, durante os estágios larvais iniciais (L1-L3) para consumir c. albicans. Para exposição a agentes farmacológicos tais como fluconazol ( Figura 3B), o agente é introduzido à mistura de infecção. A concentração do agente é determinada empiricamente. Por exemplo, na Figura 3B, 50 µM Fluconazole é representada, no entanto 0, 12.5, 25, 50 e 100 µM fluconazol também foram testados usando o mesmo protocolo.</li>
	</ol></li></ol> 8. Análise do fenótipo deformado região Anal (Dar) e sobrevivência do ensaio <ol><li>Visualize o fenótipo de Dar Nota: Dar é melhor visualizado na fase L3 e além. Dar apresenta-se como uma pequena saliência na região anal post do worm ( Figura 2A), que se torna mais proeminente ao longo do tempo.
	<ol><li>Confirmar se um animal tem Dar tocando rapidamente a placa no palco do microscópio dissecação; animais sem Dar vontade de mover para trás imediatamente, enquanto animais com Dar serão necessário repetidas rodadas de escutas para reverter sua direção, ou eles Não vai fazê-lo em tudo.</li>
	</ol></li> <li>Ensaio de sobrevivência <ol><li>preparação de ovo completo conforme descrita anteriormente na etapa de protocolo 6, &#34; ovo preparação &#34;. Conte com o ovo no âmbito de dissecação e diluir a solução de ovo com M9 até que seja alcançada uma concentração de aproximadamente 5-6 ovos saudáveis por µ l. Utilizando uma pipeta, dispensar 20 µ l da amostra contendo aproximadamente 30 ovos na chapa de NGM preparado, na área entre a cultura bacteriana e do lado da placa (ovos e comida de verme, OP50, estão em dois pontos distintos).</li>
		Incubar as placas a 20 ° C, durante 48 h de <li>. Sob um microscópio de dissecação, conte o número de vermes vivos e mortos adultos em cada prato, bem como o número de minhocas com a Dar. Gravar a porcentagem com Dar.</li>
		<li>Considerar um animal morto, se ele não responder a ser batido na cabeça por um fio de alumínio ou toque na placa.</li>
		<li>Todos os dias, transferir germes adultos restantes por colheita conforme descrito na etapa de protocolo 5, &#34; Chunking e escolhendo Worms, &#34; em um prato novo de infecção ou controle. Neste ponto, se necessário, realizar um ensaio de sobrevivência do número de vermes vivos, mortos e desaparecidos de rastreamento de cada dia. 
		Nota: Este ensaio poderá ser executada por duas semanas, começando com a preparação do ovo. Além disso, a solução de ovo não deve ser dispensada para a cultura bacteriana, como a solução pode conter vestígios de água sanitária que pode matar o OP50. A solução também deve ser dispensado de aproximadamente 0,5 cm da borda da placa, como ovos podem ficar preso entre os lados da placa e o ágar-ágar. Além disso, devido à rápida proliferação de vermes, transferência de adultos nas novas chapas é fundamental para separá-los dos seus descendentes.</li>
	</ol></li> <li>Sobrevivência analisar <ol><li>analisar resultados usando software de análise de curva de sobrevivência (consulte a lista de materiais).</li>
		<li>Compare sobrevivência curvas usando o método Grehan-Breslow-Wilcoxon (supondo que os dados dos primeiros tempos de sobrevivência são mais precisos do que tempos mais tarde, peso adequadamente os dados) bem como de ferramentas estatísticas de Logrank 45. 
		Nota: Por exemplo, na Figura 4B -C, a sobrevivência das minhocas tratados com mutante c. albicans é comparada com aqueles tratados com controles de tipo selvagem isogénicas ou complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos para análise do c. elegans infecção e sobrevivência sobre exposição de vida a c. albicans que descrevemos podem ser modificados para testar outro patógeno. Culturas líquidas de outra bactéria ou fungo podem ser feitas e alimentadas a c. elegans de forma semelhante. Além disso, infecções seriais podem ser analisadas primeiro, expondo a larva de um patógeno conforme descrito, e depois transferir os animais para uma nova placa contendo um patógeno separado depois de ating...

C. elegans tem sido usado como um organismo modelo poderoso para mais de 50 anos. Na década de 1960, o biólogo Sul-Africano Sydney Brenner foi pioneira no uso de c. elegans , para estudar o desenvolvimento neuronal, pavimentando o caminho para uma longa linhagem de cientistas para estudar os vários aspectos da biologia celular e animal em nematoides. Esta linhagem inclui Prêmio Nobel laureates Craig Mello e Andrew Fire para o seu trabalho de RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston por seu trabalho no desenvolvimento de órgãos e apoptose2,3,4e Martin Chalfie por seu trabalho na proteína fluorescente verde5. Embora este organismo modelo tem sido tradicionalmente usado para estudar a biologia molecular e do desenvolvimento, nos últimos 15 anos, os pesquisadores começaram a usar c. elegans para investigar a biologia de vários patógenos humanos incluindo Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureuse Salmonella typhi6,7,8,9,10. Estes estudos revelaram que muitos dos mecanismos envolvidos na interação humano-patógeno são conservados em nematódeos, mas também que existem alguns mecanismos de imunidade que são exclusivos para este organismo de modelo11,12. Na natureza, c. elegans encontra uma variedade de ameaças de patógenos ingeridos presentes no solo e isso proporcionou uma forte pressão seletiva para evoluir e manter um sofisticado sistema imune inato no seu lúmen intestinal. Muitos dos genes e mecanismos envolvidos na proteção do lúmen intestinal são orquestrados por elementos altamente conservada que também existem em maior mamíferos11,13. C. elegans , portanto, representa um grande modelo para estudar a patógenos gastrointestinais como a Salmonella typhi14, Shigella boydii15ou Vibrio cholera16.
Aqui destacamos a versatilidade notável de c. elegans como um host de modelo para o estudo de agentes infecciosos, tais como c. albicans. C. elegans como um anfitrião modelo permite o rastreio de alto rendimento de virulência que é menos caro e demorado do que um modelo do rato, que é comumente usado para estudar a candidíase42.
Neste estudo, mostramos que este modelo e o ensaio de sobrevivência de assosiated podem ser confiável usados para estudar inata efetores hospedeiro imune importantes para combater infecções, determinantes do patógeno que impulsionam a virulência, e compostos farmacológicos que podem intervir na patogênese. Diferentes tipos de ensaios descritos anteriormente, este método fornece um meio de exposição a um agente patogénico a estudar sobre a vida do animal, desde a fase larval para a idade adulta, ao invés de apenas idade adulta a morte de43,44. Em resumo, nosso c. elegans - modelo de c. albicans é uma ferramenta versátil e poderosa que pode ser usada não somente para estudar as bases genéticas que levam a infecção e imunidade, mas também para identificar novos compostos para a intervenção terapêutica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Vamos demonstrar um método usando Caenorhabditis elegans como um anfitrião modelo para estudar a interação microbiana. Micróbios são introduzidos através da dieta, tornando o intestino o local principal para a doença. O nematoide intestino estrutural e funcionalmente imita os intestinos de mamíferos e é transparente, tornando-se passível de estudo microscópico da colonização. Aqui nós mostramos que patógenos podem causar doenças e morte. Somos capazes de identificar microbianos mutantes que mostram a virulência alterada. Sua resposta inata conservada a estresses bióticos faz c. elegans , um excelente sistema para sondar as facetas de interações imune inata do hospedeiro. Mostramos que hosts com mutações no gene oxidase dual não podem produzir espécies reactivas de oxigénio e são incapazes de resistir insulto microbiano. Vamos demonstrar ainda mais a versatilidade do ensaio apresentado sobrevivência, mostrando que ele pode ser usado para estudar os efeitos de inibidores do crescimento microbiano. Este ensaio também pode ser usado para descobrir os fatores de virulência de fungos como alvos para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, bem como fornecer uma oportunidade para descobrir novas interações do anfitrião-micróbio. O design deste teste se presta bem para alta taxa de transferência do inteiro-genoma telas, enquanto a capacidade de vermes de crio-preservação para uso futuro torna um modelo todo animal rentável e atraente para estudar.

Um ensaio de patogênese (Figura 1) usando a c. albicans e c. elegans tem sido descrito anteriormente por nosso laboratório17,18 e outros laboratórios19,20. Demonstramos a acessibilidade de usando o c. elegans para estudar a virulência de c. albicans , mostrando que as células de c. albicans sã...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K visualizações.  Worcester Polytechnic Institute. Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

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Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Manipulação genética do patógeno de planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudar Biologia fúngicos e vegetais Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulação de ploidia em Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Cultura e Ensaio de Caenorhabditis em Grande Escala populações elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

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Manipulação genética do patógeno de planta

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em