Name: the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
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Diese Arbeit wurde durchgeführt und unterstützt von Worcester Polytechnic Institute.

1. Vorbereitung der Nematode Wachstum Medium (NGM) <ol><li>für 1 L der Medien, zu kombinieren, 20 g Agar, 2,5 g organischer Stickstoff-Quelle (z.B., Bacto-Pepton) und 3 g Natrium-Chlorid in eine 2 L Flasche. 975 mL sterilem Wasser hinzugeben.
	<ol><li>Add in einer sterilen Stir Bar. Wenn eine automatische Media Ausgießer, Autoklaven Tubing und Medien für 15 min; Medien sollten Autoklaven für mehr wenn ein höheres Volumen erfolgt.</li>
	</ol></li> <li>Medien auf Platte rühren und abkühlen lassen.
	<ol><li>Sobald Medien warm an (ca. 60 ° C) aseptisch ist fügen Sie 1 mL 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 und 1 mL 0,5 % Cholesterin im Äthanol.</li>
		<li>Medien (von hand oder durch automatische Pumpe) unter Laminar-Flow in Gießen 35 mm x 10 mm sterile Petrischalen. Unter Haube für 1-2 Tage vor dem Gebrauch trocknen lassen. 
		Hinweis: Platten sollten gespeichert werden, bei 4 ° C um Kontaminationen zu vermeiden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Macht ein Wurm holen <ol><li>schneiden Sie ein 1,5 cm Stück von Aluminiumdraht. Legen Sie ca. 0,5 cm Länge in der Spitze einer Pasteurpipette.
	<ol><li>Mit einem Bunsenbrenner oder Alkohol-Lampe, schmelzen die Pipettenspitze Glas durch langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher auf die Pipette eingehalten wird, ohne die ursprüngliche Form des die Pipettenspitze.</li>
	</ol></li></ol> 3. Vorbereitung der E. Coli-Kultur <ol><li>mit einer sterilen Schleife, einzige Kolonie von E. Coli-Stamm OP50 in 200 mL Brühe Luria impfen. Inkubation über Nacht unter Schütteln bei 37 ° c</li>
	<li>Die Flüssigkultur ist bereit für den Einsatz am Folgetag und bei 4 ° C bei Nichtgebrauch gespeichert werden können. 
	Hinweis: Die E. Coli-Stamm, OP50, dient als Nahrungsquelle für C. Elegans. Dieser Kultur verwendet werden, für bis zu mehrere Monate bei 4 ° c</li>
</ol> 4. Wesentlichen C. Elegans Wartung <ol><li>Samen NGM Agarplatten mit E. Coli von Schmierblutungen etwa 50-100 µL bereit OP50 Flüssigkultur in die Mitte des Tellers vorbereitet.</li>
	<li>Abdeckplatten und bei Raumtemperatur für 24 Std. trocknen lassen. Nach dem Trocknen legen Platten bei 37 ° C über Nacht für ein schnelles Wachstum oder halten bei Raumtemperatur, wenn langsameres Wachstum gewünscht wird.</li>
	<li>Der Platte Würmer hinzufügen, indem entweder &#34; chunking, &#34; (siehe Protokoll Schritt 5 &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer &#34;), Kommissionierung Würmer einzeln oder Wurm Eiern direkt auf den Teller zu platzieren (siehe Protokoll Schritt 6 &#34; Ei Vorbereitung &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking und Kommissionierung Würmer Hinweis: &#34; Chunking, &#34; bezieht sich auf eine Praxis, die häufig in C. Elegans Wartung. Dabei schneiden einen Abschnitt der NGM-Agar-Platte, die Würmer enthält, und dieses Stück auf eine neue Platte zu übertragen, damit auch eine große Anzahl von Würmern im Prozess übertragen. Verschmutzung kann auch aus der Platte auf diese Weise geschnitten werden. Bei der Kommissionierung Würmer, ist es wichtig, die Integrität des Nährbodens zu pflegen, denn Würmer in Löcher im Agar verloren gehen können. Darüber hinaus ist es wichtig, damit die Abholung abkühlen, bevor Sie die Platte, um zu verhindern, dass der Agar schmelzen oder brennen die Würmer berühren können.
<ol><li>Um schnell große Mengen an Würmern auf neue Teller übertragen schneiden Sie ein Stück der NGM-Agar, enthält die ausgewählten Würmer mit einem Spatel. Entfernen Sie das geschnittene Stück und legen Sie es Gesicht nach unten am Rand des Rasens OP50 auf eine neue Platte.</li>
	<li>Transfer Würmer einzeln wie folgt im Protokoll Schritt 8.2, &#34; Survival Test, &#34; mit einem Wurm nehmen. Flamme des Drahtes in der Wurm holen bis es rot ist. Von der Flamme entfernen und für ein paar Sekunden abkühlen lassen.</li>
	<li>Mit den Draht auf die Abholung, sanft den Rasen der OP50 Kultur angebaut auf der neuen Platte, über den Draht auf die Pick kratzen.</li>
	<li>Die Viskose Kultur über die Spitze des Drahtes macht Würmer halten Sie sich an die Spitze der Abholung, so sanft ausgewählten Würmer mit einer swiping Bewegung abholen.</li>
	<li>Nach ausgewählten Würmer versammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte durch sanft streichen Kultur auf Agar. Legen Sie den Draht in die Flamme, verbleibenden Kultur bei der Abholung zu entfernen.</li>
</ol> 6. Ei-Vorbereitung <ol><li>Ort etwa 20 ausgewachsene Tiere (ca. 2-3 Tage nach dem Schlupf, wenn gewachsen bei 20 ° C) durch entweder Abnehmen oder chunking gemäß Protokoll Schritt 5, &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer, &#34; auf einen Teller mit 50 ausgesät µL der E. Coli-Stamm, OP50.</li>
	<li>Zu die Eiern sammeln, überfluten die Platte mit 10 mL der M9 Puffer nach 1-2 Tagen. Mit Hilfe einer serologischen Glaspipette, wirbeln Sie und schütteln Sie sanft den Inhalt auf der Agarplatte freizugebende Eiern OP50 oder Erwachsene Tiere stecken. Sammeln Sie alle Flüssigkeit, die mit den Eiern und Erwachsene.</li>
	<li>Transfer M9 und OP50 Lösung in einem 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie 15 mL konische Rohr bei 2.100 x g für 2 min.</li>
	<li>Ca. 9 mL überstand ohne störende OP50 Pellet Aspirieren.</li>
	<li>Das Pellet in 2 mL sterilem Wasser, 1 mL der Bleichmittel und 1 mL von 0,25 M NaOH Aufschwemmen.</li>
	<li>Vorsichtig mischen durch umdrehen, bis die Mehrzahl (ca. 70 Prozent) der erwachsenen Tiere lysierten erscheinen, in der Regel Eiern bleiben während dieser kurzen Bleichmittel Behandlung wegen ihrer Schale. Das konische Rohr auf 990 X g für 2 min. Zentrifugieren</li>
	<li>Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Wieder aussetzen das Pellet in 10 mL Puffer M9.</li>
	<li>Zentrifuge das konische Rohr in 990 X g für 2 min. Aspirat überstand ohne störende Pellet. Wieder aussetzen Pellet mit 200 µL Puffer M9. 
	Hinweis: Ei Vorbereitung kann mehrere Versuche erforderlich. Eiern können zerstört werden, wenn sie zu lange bleichen ausgesetzt sind. Wenn nicht schlüpfen, verringern Sie die Konzentration der Bleichmittel in Lösung oder verringern die Dauer der Exposition zu bleichen.</li>
</ol> 7. Infektion Teller Set-up <ol><li>3-5 mL YPD in ein steriles Röhrchen zu verzichten und mit einer einzigen Kolonie von Candida Albicans mit einer sterilen Schleife zu impfen.
	<ol><li>Legen Sie das Rohr auf einer rotatorischen Trommel für ca. 16-18 h bei 30 ° c</li>
	</ol></li> <li>Label eine 1,5 mL Microfuge Röhre zu C. Albicans und anderen OP50 enthalten enthalten. Nehmen Sie das Gewicht jedes Leerrohr.
	<ol><li>Ort 500 µL der Übernachtungen C. Albicans Kultur in Rohr gekennzeichnet C. Albicans und 1.500 µL der Nacht OP50 Kultur (aus Schritt 3.1) in das Rohr mit der Bezeichnung OP50.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 16.100 x g. Aspirat überstand ohne störende Pellet.</li>
		<li>Wieder aussetzen jedes Pellet mit 500 µL steriles Wasser. Zentrifuge für 5 min bei 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Aufnehmen das Endgewicht von Microfuge Rohren.</li>
		<li>Bestimmen das Gewicht jedes Pellet durch Subtraktion das Ausgangsgewicht der Microfuge Rohre aus der Auswaage.</li>
	</ol></li> <li>Mit sterilem Wasser wieder auszusetzen, C. Albicans Pellet bis 10 mg/mL und die OP50 Pellet bis 200 mg/mL. Machen Sie eine master-Infektion durch die Kombination von 10 µL einer Lösung von 50 mg/mL von Streptomycin, 2,5 µL OP50 Kultur, 0,5 µL von C. Albicans Kultur und 7 µL steriles Wasser mischen.
	<ol><li>Für Steuerplatten, einen master-Mix zu schaffen, indem die Lautstärke von C. Albicans Kultur mit sterilem Wasser. Seed 20 µL der Infektion Mix oder OP50-Control-Lösung auf die Mitte der NGM-Teller mit einer Mikropipette. 
		Hinweis: Rund 100 Würmer sind erforderlich, um statistische Signifikanz bei der Analyse bestimmen. Dieser Test ist in der Regel in dreifacher Ausführung ausgeführt. Somit erfolgt eine 3,2 x Infektion Mischung sowie eine 3,2 x Kontrolllösung. Diese Mischungen sind gemacht, um etwas mehr als 3 x das Original um sicherzustellen, dass eine volle 20 µL auf jede Platte, so dass Raum für Fehler ausgesät wird. Dieses master-Mix entsteht, weil der Rachen des Wurms im ersten Larvenstadium (L1-L3), C. Albicans konsumieren zu klein ist. Für die Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen wie Fluconazol ( Abb. 3 b) wird der Agent auf die Infektion Mischung eingeführt. Die Konzentration des Agenten wird empirisch bestimmt. Zum Beispiel in Abbildung 3 b, 50 µM Fluconazol vertreten ist, jedoch 0, 12.5, 25, 50 und 100 µM Fluconazol waren auch mit dem gleichen Protokoll getestet.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analyse der Analbereich verformt (Dar) Phänotyp und Survival Test <ol><li>visualisieren den Dar-Phänotyp Hinweis: Dar ist am besten visualisiert, in die L3-Stadium und darüber hinaus. Dar präsentiert sich als eine kleine Vorwölbung im Analbereich Post des Wurms ( Abbildung 2A), die im Laufe der Zeit stärker wird.
	<ol><li>Bestätigen, falls ein Tier Dar, indem man schnell die Platte auf der Bühne des Mikroskops Dissektion; Tiere ohne Dar Willen rückwärts sofort bewegen, während Tiere mit Dar entweder werden wiederholt runden klopfen, oder sie ihre Richtung umkehren wird das auch gar nicht tun.</li>
	</ol></li> <li>Überleben Assay <ol><li>komplette Ei Vorbereitung wie oben beschrieben im Protokoll Schritt 6, &#34; Ei Vorbereitung &#34;. Zählen Sie die Eizellen im Rahmen der Dissektion und verdünnen Sie die Ei-Lösung mit M9 zu, bis eine Konzentration von ca. 5-6 gesunden Eizellen pro Mikroliter erreicht ist. Mit einer Pipette 20 µL Probe mit ca. 30 Eiern auf vorbereiteten NGM-Teller, im Bereich zwischen der bakteriellen Kultur und der Seite der Platte zu verzichten (Eiern und Wurm Essen, OP50, sind in zwei unterschiedlichen Spots).</li>
		<li>Platten Inkubation bei 20 ° C für 48 h. Zählen Sie unter dem Mikroskop Dissektion die Anzahl der Leben und tot Erwachsene Würmer auf jeder Platte, sowie die Anzahl der Würmer mit Dar. Aufzeichnen der Prozent mit Dar.</li>
		<li>Ein Tier tot betrachten, wenn es nicht antwortet, wird auf den Kopf von einem Aluminiumdraht oder durch Tippen auf die Platte angezapft.</li>
		<li>Jeden zweiten Tag transfer restlichen Erwachsenen Würmer mit Kommissionierung, wie im Protokoll Schritt 5 beschrieben &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer, &#34; auf eine neue Infektion oder Kontrolle. An dieser Stelle bei Bedarf einen Überlebens-Assay durch tracking-Nummer live, Tote und vermisste Würmer pro Tag durchführen. 
		Hinweis: Dieser Test kann für zwei Wochen laufen beginnend mit Ei-Vorbereitung. Darüber hinaus sollte die Ei-Lösung auf die Bakterienkultur nicht verzichtet werden, da die Lösung kann Spuren von Bleichmittel enthalten, die die OP50 töten kann. Die Lösung sollte ca. 0,5 cm vom Rand der Platte verzichtet, wie Eiern zwischen den Seiten der Platte und der Agar geklebt werden können. Darüber hinaus aufgrund der schnellen Verbreitung von Würmern, Übertragung von Erwachsenen auf neue Teller ist entscheidend für die sie von ihren Nachkommen zu trennen.</li>
	</ol></li> <li>Analysieren überleben <ol><li>Ergebnisse mit überleben Kurve Analysesoftware zu analysieren (siehe Materialliste).</li>
		<li>Vergleichen Überleben Kurven mit der Grehan Breslow Wilcoxon-Methode (unter der Annahme, dass die Daten vom frühen Überlebenszeiten genauer als die späteren Zeiten, Gewicht die Daten entsprechend) sowie Form Statistikwerkzeugen 45. 
		Hinweis: Zum Beispiel in Abbildung 4 b -C, das Überleben der Würmer mit Mutant C. Albicans behandelt ist im Vergleich zu den behandelten mit isogenen Wildtyp Steuerelemente oder Complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Infektion und das Überleben Lebensdauer Überbelichtung zu C. Albicans , die wir beschrieben haben können geändert werden, um eine andere Erreger zu testen. Flüssige Kulturen anderer Bakterien oder Pilze können gemacht und C. Elegans in ähnlicher Weise zugeführt. Darüber hinaus können serielle Infektionen untersucht werden durch die Larve zu einem Erreger zunächst auszusetzen, wie beschrieben, und dann die Übertragung der Tiere auf eine ne...

C. Elegans hat seit mehr als 50 Jahren als leistungsstarke Modellorganismus eingesetzt. In den 1960er Jahren Pionier südafrikanischer Biologe Sydney Brenner im Einsatz von C. Elegans , neuronale Entwicklung zu studieren ebnet den Weg für eine lange Linie von Wissenschaftlern, verschiedene Aspekte der Zell- und Biologie in Nematoden zu studieren. Diese Linie umfasst Nobelpreisträger Craig Mello und Andrew Fire für ihre RNAi Arbeit1, Robert Horvitz und John Sulston für ihre Arbeit über die Organentwicklung und Apoptose2,3,4, und Martin Chalfie für seine Arbeiten über grün fluoreszierendes Protein5. Obwohl diese Modellorganismus traditionell verwendet wurde, um Entwicklungsstörungen Molekularbiologie, in den vergangenen 15 Jahren zu studieren, haben Forscher damit begonnen, C. Elegans zu verwenden, um die Biologie der verschiedenen menschlichen Krankheitserreger einschließlich Pseudomonas untersuchen Aeruginosa, Staphylococcus Aureus, Salmonellen Entericaund Serratia Marcescens6,7,8,9,10. Diese Studien zeigten, dass viele der Mechanismen der Interaktion Mensch-Erreger beteiligt sind konserviert in Nematoden, aber auch das gibt es einige Immunität-Mechanismen, die einzigartig für dieses Modell Organismus11,12. In der Natur C. Elegans Begegnungen einer Vielzahl von Bedrohungen aus aufgenommenen Krankheitserreger im Boden vorhanden, und dies hat einen starken Selektionsdruck zu entwickeln und zu pflegen eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem in seiner Darmlumen zur Verfügung gestellt. Viele der Gene und Mechanismen, die im Bereich des Darmlumens werden durch hoch konserviert Elemente orchestriert, die gibt es auch in höheren Säugetiere11,13. C. Elegans stellt daher ein großes Modell, Magen-Darm-Erreger wie Salmonella Enterica14, Shigella Boydii15oder Vibrio Cholera16zu studieren.
Hier heben wir die bemerkenswerte Vielseitigkeit von C. Elegans als Modell Host Infektionserreger wie C. Albicanszu studieren. C. Elegans als Modell Host ermöglicht Hochdurchsatz-Screening für Virulenz, das ist weniger teuer und zeitaufwändig als ein Mausmodell, das häufig verwendet wird, um Candidiasis42zu studieren.
In dieser Studie zeigen wir, dass dieses Modell und ihre überleben Assay zuverlässig genutzt werden können, für das Studium Host angeborenen Immunsystem Effektoren wichtig gegen Infektionen, Erreger Determinanten, die Virulenz, fahren und pharmakologischen Verbindungen können in Pathogenese eingreifen. Ähnlich wie zuvor beschriebenen Tests diese Methode bietet eine Möglichkeit des Studiums Exposition gegenüber einem Krankheitserreger über die gesamte Lebensdauer des Tieres, vom Larvenstadium bis ins Erwachsenenalter, anstatt nur Erwachsenenalter bis Tod43,44. Zusammenfassend unsere C. Elegans - ist C. Albicans -Modell ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet werden kann, nicht nur die genetischen Grundlagen zu studieren, die Infektion und Immunität zu fahren, sondern auch neue Verbindungen für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Wir zeigen eine Methode mit Caenorhabditis Elegans als Modell Host, um mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Mikroben sind über die Ernährung machen dem Darm den primären Speicherort für die Krankheit eingeführt. Die Nematoden Darm strukturell und funktionell imitiert Säugetier-Darm und ist transparent macht es zugänglich für mikroskopische Untersuchung von Besiedlung. Hier zeigen wir, dass Krankheitserreger Krankheit und zum Tod führen können. Wir sind in der Lage, mikrobielle Mutanten zu identifizieren, die veränderten Virulenz zu zeigen. Seine erhaltenen angeborene Reaktion auf biotische betont macht C. Elegans ein ausgezeichnetes System Facetten des angeborenen Immunsystems Wirt Interaktionen zu untersuchen. Wir zeigen, dass Hosts mit Mutationen im gen duale Oxidase nicht reaktiven Sauerstoffspezies produzieren und sind nicht in der Lage, mikrobielle Beleidigung zu widerstehen. Weiter zeigen wir die Vielseitigkeit des vorgestellten überleben Tests zeigen, dass es zur Untersuchung der Auswirkungen von Inhibitoren des mikrobiellen Wachstums verwendet werden kann. Dieser Test kann auch verwendet werden, entdecken Pilz Virulenzfaktoren als Ziele für die Entwicklung von neuartigen Antimykotika, sowie bieten die Möglichkeit, weitere Host-Mikroben-Interaktionen aufzudecken. Das Design dieser Assay eignet sich gut für hohen Durchsatz Vollständiggenom Bildschirme, während die Fähigkeit, Cryo-Konserve Würmer für zukünftigen Gebrauch es eine kostengünstige und attraktive ganze Tiermodell macht zu studieren.

Eine Pathogenese-Assay (Abb. 1) mit C. Albicans und C. Elegans wurde zuvor von unserem Labor17,18 und andere Labors19,20beschrieben. Wir zeigen die Bereitschaft der Verwendung von C. Elegans , um C. Albicans Virulenz zeigen, dass C. Albicans Zellen von den Würmern schnell aufgenommen werden und rei...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K Aufrufe.  Worcester Polytechnic Institute. Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Serie: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>Zwei Infektionsassays zur Untersuchung nicht-letaler Virulenz-Phänotypen bei C. albicans unter Verwendung von C. elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

Zwei Infektionsassays zur Untersuchung nicht-letaler Virulenz-Phänotypen bei C. albicans unter Verwendung von C. elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Forschung

Genetik

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Immunologie und Infektion

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Biologie

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Zusammenfassung

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Zwei Infektionsassays zur Untersuchung nicht-letaler Virulenz-Phänotypen bei C. albicans unter Verwendung von C. elegans

Zwei Infektionsassays zur Untersuchung nicht-letaler Virulenz-Phänotypen bei C. albicans unter Verwendung von C. elegans

Automatische Trennung von

Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas Infektion in einem Caenorhabditis Elegans -Modell

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans