Diese Arbeit wurde durchgeführt und unterstützt von Worcester Polytechnic Institute.

1. Vorbereitung der Nematode Wachstum Medium (NGM) <ol><li>für 1 L der Medien, zu kombinieren, 20 g Agar, 2,5 g organischer Stickstoff-Quelle (z.B., Bacto-Pepton) und 3 g Natrium-Chlorid in eine 2 L Flasche. 975 mL sterilem Wasser hinzugeben.
	<ol><li>Add in einer sterilen Stir Bar. Wenn eine automatische Media Ausgießer, Autoklaven Tubing und Medien für 15 min; Medien sollten Autoklaven für mehr wenn ein höheres Volumen erfolgt.</li>
	</ol></li> <li>Medien auf Platte rühren und abkühlen lassen.
	<ol><li>Sobald Medien warm an (ca. 60 ° C) aseptisch ist fügen Sie 1 mL 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 und 1 mL 0,5 % Cholesterin im Äthanol.</li>
		<li>Medien (von hand oder durch automatische Pumpe) unter Laminar-Flow in Gießen 35 mm x 10 mm sterile Petrischalen. Unter Haube für 1-2 Tage vor dem Gebrauch trocknen lassen. 
		Hinweis: Platten sollten gespeichert werden, bei 4 ° C um Kontaminationen zu vermeiden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Macht ein Wurm holen <ol><li>schneiden Sie ein 1,5 cm Stück von Aluminiumdraht. Legen Sie ca. 0,5 cm Länge in der Spitze einer Pasteurpipette.
	<ol><li>Mit einem Bunsenbrenner oder Alkohol-Lampe, schmelzen die Pipettenspitze Glas durch langsam in der Flamme drehen, bis der Draht sicher auf die Pipette eingehalten wird, ohne die ursprüngliche Form des die Pipettenspitze.</li>
	</ol></li></ol> 3. Vorbereitung der E. Coli-Kultur <ol><li>mit einer sterilen Schleife, einzige Kolonie von E. Coli-Stamm OP50 in 200 mL Brühe Luria impfen. Inkubation über Nacht unter Schütteln bei 37 ° c</li>
	<li>Die Flüssigkultur ist bereit für den Einsatz am Folgetag und bei 4 ° C bei Nichtgebrauch gespeichert werden können. 
	Hinweis: Die E. Coli-Stamm, OP50, dient als Nahrungsquelle für C. Elegans. Dieser Kultur verwendet werden, für bis zu mehrere Monate bei 4 ° c</li>
</ol> 4. Wesentlichen C. Elegans Wartung <ol><li>Samen NGM Agarplatten mit E. Coli von Schmierblutungen etwa 50-100 µL bereit OP50 Flüssigkultur in die Mitte des Tellers vorbereitet.</li>
	<li>Abdeckplatten und bei Raumtemperatur für 24 Std. trocknen lassen. Nach dem Trocknen legen Platten bei 37 ° C über Nacht für ein schnelles Wachstum oder halten bei Raumtemperatur, wenn langsameres Wachstum gewünscht wird.</li>
	<li>Der Platte Würmer hinzufügen, indem entweder &#34; chunking, &#34; (siehe Protokoll Schritt 5 &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer &#34;), Kommissionierung Würmer einzeln oder Wurm Eiern direkt auf den Teller zu platzieren (siehe Protokoll Schritt 6 &#34; Ei Vorbereitung &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking und Kommissionierung Würmer Hinweis: &#34; Chunking, &#34; bezieht sich auf eine Praxis, die häufig in C. Elegans Wartung. Dabei schneiden einen Abschnitt der NGM-Agar-Platte, die Würmer enthält, und dieses Stück auf eine neue Platte zu übertragen, damit auch eine große Anzahl von Würmern im Prozess übertragen. Verschmutzung kann auch aus der Platte auf diese Weise geschnitten werden. Bei der Kommissionierung Würmer, ist es wichtig, die Integrität des Nährbodens zu pflegen, denn Würmer in Löcher im Agar verloren gehen können. Darüber hinaus ist es wichtig, damit die Abholung abkühlen, bevor Sie die Platte, um zu verhindern, dass der Agar schmelzen oder brennen die Würmer berühren können.
<ol><li>Um schnell große Mengen an Würmern auf neue Teller übertragen schneiden Sie ein Stück der NGM-Agar, enthält die ausgewählten Würmer mit einem Spatel. Entfernen Sie das geschnittene Stück und legen Sie es Gesicht nach unten am Rand des Rasens OP50 auf eine neue Platte.</li>
	<li>Transfer Würmer einzeln wie folgt im Protokoll Schritt 8.2, &#34; Survival Test, &#34; mit einem Wurm nehmen. Flamme des Drahtes in der Wurm holen bis es rot ist. Von der Flamme entfernen und für ein paar Sekunden abkühlen lassen.</li>
	<li>Mit den Draht auf die Abholung, sanft den Rasen der OP50 Kultur angebaut auf der neuen Platte, über den Draht auf die Pick kratzen.</li>
	<li>Die Viskose Kultur über die Spitze des Drahtes macht Würmer halten Sie sich an die Spitze der Abholung, so sanft ausgewählten Würmer mit einer swiping Bewegung abholen.</li>
	<li>Nach ausgewählten Würmer versammelt sind, legen Sie sie auf eine neue Platte durch sanft streichen Kultur auf Agar. Legen Sie den Draht in die Flamme, verbleibenden Kultur bei der Abholung zu entfernen.</li>
</ol> 6. Ei-Vorbereitung <ol><li>Ort etwa 20 ausgewachsene Tiere (ca. 2-3 Tage nach dem Schlupf, wenn gewachsen bei 20 ° C) durch entweder Abnehmen oder chunking gemäß Protokoll Schritt 5, &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer, &#34; auf einen Teller mit 50 ausgesät µL der E. Coli-Stamm, OP50.</li>
	<li>Zu die Eiern sammeln, überfluten die Platte mit 10 mL der M9 Puffer nach 1-2 Tagen. Mit Hilfe einer serologischen Glaspipette, wirbeln Sie und schütteln Sie sanft den Inhalt auf der Agarplatte freizugebende Eiern OP50 oder Erwachsene Tiere stecken. Sammeln Sie alle Flüssigkeit, die mit den Eiern und Erwachsene.</li>
	<li>Transfer M9 und OP50 Lösung in einem 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie 15 mL konische Rohr bei 2.100 x g für 2 min.</li>
	<li>Ca. 9 mL überstand ohne störende OP50 Pellet Aspirieren.</li>
	<li>Das Pellet in 2 mL sterilem Wasser, 1 mL der Bleichmittel und 1 mL von 0,25 M NaOH Aufschwemmen.</li>
	<li>Vorsichtig mischen durch umdrehen, bis die Mehrzahl (ca. 70 Prozent) der erwachsenen Tiere lysierten erscheinen, in der Regel Eiern bleiben während dieser kurzen Bleichmittel Behandlung wegen ihrer Schale. Das konische Rohr auf 990 X g für 2 min. Zentrifugieren</li>
	<li>Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Wieder aussetzen das Pellet in 10 mL Puffer M9.</li>
	<li>Zentrifuge das konische Rohr in 990 X g für 2 min. Aspirat überstand ohne störende Pellet. Wieder aussetzen Pellet mit 200 µL Puffer M9. 
	Hinweis: Ei Vorbereitung kann mehrere Versuche erforderlich. Eiern können zerstört werden, wenn sie zu lange bleichen ausgesetzt sind. Wenn nicht schlüpfen, verringern Sie die Konzentration der Bleichmittel in Lösung oder verringern die Dauer der Exposition zu bleichen.</li>
</ol> 7. Infektion Teller Set-up <ol><li>3-5 mL YPD in ein steriles Röhrchen zu verzichten und mit einer einzigen Kolonie von Candida Albicans mit einer sterilen Schleife zu impfen.
	<ol><li>Legen Sie das Rohr auf einer rotatorischen Trommel für ca. 16-18 h bei 30 ° c</li>
	</ol></li> <li>Label eine 1,5 mL Microfuge Röhre zu C. Albicans und anderen OP50 enthalten enthalten. Nehmen Sie das Gewicht jedes Leerrohr.
	<ol><li>Ort 500 µL der Übernachtungen C. Albicans Kultur in Rohr gekennzeichnet C. Albicans und 1.500 µL der Nacht OP50 Kultur (aus Schritt 3.1) in das Rohr mit der Bezeichnung OP50.</li>
		<li>Zentrifuge für 10 min bei 16.100 x g. Aspirat überstand ohne störende Pellet.</li>
		<li>Wieder aussetzen jedes Pellet mit 500 µL steriles Wasser. Zentrifuge für 5 min bei 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirat überstand ohne zu stören das Pellet. Aufnehmen das Endgewicht von Microfuge Rohren.</li>
		<li>Bestimmen das Gewicht jedes Pellet durch Subtraktion das Ausgangsgewicht der Microfuge Rohre aus der Auswaage.</li>
	</ol></li> <li>Mit sterilem Wasser wieder auszusetzen, C. Albicans Pellet bis 10 mg/mL und die OP50 Pellet bis 200 mg/mL. Machen Sie eine master-Infektion durch die Kombination von 10 µL einer Lösung von 50 mg/mL von Streptomycin, 2,5 µL OP50 Kultur, 0,5 µL von C. Albicans Kultur und 7 µL steriles Wasser mischen.
	<ol><li>Für Steuerplatten, einen master-Mix zu schaffen, indem die Lautstärke von C. Albicans Kultur mit sterilem Wasser. Seed 20 µL der Infektion Mix oder OP50-Control-Lösung auf die Mitte der NGM-Teller mit einer Mikropipette. 
		Hinweis: Rund 100 Würmer sind erforderlich, um statistische Signifikanz bei der Analyse bestimmen. Dieser Test ist in der Regel in dreifacher Ausführung ausgeführt. Somit erfolgt eine 3,2 x Infektion Mischung sowie eine 3,2 x Kontrolllösung. Diese Mischungen sind gemacht, um etwas mehr als 3 x das Original um sicherzustellen, dass eine volle 20 µL auf jede Platte, so dass Raum für Fehler ausgesät wird. Dieses master-Mix entsteht, weil der Rachen des Wurms im ersten Larvenstadium (L1-L3), C. Albicans konsumieren zu klein ist. Für die Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen wie Fluconazol ( Abb. 3 b) wird der Agent auf die Infektion Mischung eingeführt. Die Konzentration des Agenten wird empirisch bestimmt. Zum Beispiel in Abbildung 3 b, 50 µM Fluconazol vertreten ist, jedoch 0, 12.5, 25, 50 und 100 µM Fluconazol waren auch mit dem gleichen Protokoll getestet.</li>
	</ol></li></ol> 8. Analyse der Analbereich verformt (Dar) Phänotyp und Survival Test <ol><li>visualisieren den Dar-Phänotyp Hinweis: Dar ist am besten visualisiert, in die L3-Stadium und darüber hinaus. Dar präsentiert sich als eine kleine Vorwölbung im Analbereich Post des Wurms ( Abbildung 2A), die im Laufe der Zeit stärker wird.
	<ol><li>Bestätigen, falls ein Tier Dar, indem man schnell die Platte auf der Bühne des Mikroskops Dissektion; Tiere ohne Dar Willen rückwärts sofort bewegen, während Tiere mit Dar entweder werden wiederholt runden klopfen, oder sie ihre Richtung umkehren wird das auch gar nicht tun.</li>
	</ol></li> <li>Überleben Assay <ol><li>komplette Ei Vorbereitung wie oben beschrieben im Protokoll Schritt 6, &#34; Ei Vorbereitung &#34;. Zählen Sie die Eizellen im Rahmen der Dissektion und verdünnen Sie die Ei-Lösung mit M9 zu, bis eine Konzentration von ca. 5-6 gesunden Eizellen pro Mikroliter erreicht ist. Mit einer Pipette 20 µL Probe mit ca. 30 Eiern auf vorbereiteten NGM-Teller, im Bereich zwischen der bakteriellen Kultur und der Seite der Platte zu verzichten (Eiern und Wurm Essen, OP50, sind in zwei unterschiedlichen Spots).</li>
		<li>Platten Inkubation bei 20 ° C für 48 h. Zählen Sie unter dem Mikroskop Dissektion die Anzahl der Leben und tot Erwachsene Würmer auf jeder Platte, sowie die Anzahl der Würmer mit Dar. Aufzeichnen der Prozent mit Dar.</li>
		<li>Ein Tier tot betrachten, wenn es nicht antwortet, wird auf den Kopf von einem Aluminiumdraht oder durch Tippen auf die Platte angezapft.</li>
		<li>Jeden zweiten Tag transfer restlichen Erwachsenen Würmer mit Kommissionierung, wie im Protokoll Schritt 5 beschrieben &#34; Chunking und Kommissionierung Würmer, &#34; auf eine neue Infektion oder Kontrolle. An dieser Stelle bei Bedarf einen Überlebens-Assay durch tracking-Nummer live, Tote und vermisste Würmer pro Tag durchführen. 
		Hinweis: Dieser Test kann für zwei Wochen laufen beginnend mit Ei-Vorbereitung. Darüber hinaus sollte die Ei-Lösung auf die Bakterienkultur nicht verzichtet werden, da die Lösung kann Spuren von Bleichmittel enthalten, die die OP50 töten kann. Die Lösung sollte ca. 0,5 cm vom Rand der Platte verzichtet, wie Eiern zwischen den Seiten der Platte und der Agar geklebt werden können. Darüber hinaus aufgrund der schnellen Verbreitung von Würmern, Übertragung von Erwachsenen auf neue Teller ist entscheidend für die sie von ihren Nachkommen zu trennen.</li>
	</ol></li> <li>Analysieren überleben <ol><li>Ergebnisse mit überleben Kurve Analysesoftware zu analysieren (siehe Materialliste).</li>
		<li>Vergleichen Überleben Kurven mit der Grehan Breslow Wilcoxon-Methode (unter der Annahme, dass die Daten vom frühen Überlebenszeiten genauer als die späteren Zeiten, Gewicht die Daten entsprechend) sowie Form Statistikwerkzeugen 45. 
		Hinweis: Zum Beispiel in Abbildung 4 b -C, das Überleben der Würmer mit Mutant C. Albicans behandelt ist im Vergleich zu den behandelten mit isogenen Wildtyp Steuerelemente oder Complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methoden zur Untersuchung von C. Elegans Infektion und das Überleben Lebensdauer Überbelichtung zu C. Albicans , die wir beschrieben haben können geändert werden, um eine andere Erreger zu testen. Flüssige Kulturen anderer Bakterien oder Pilze können gemacht und C. Elegans in ähnlicher Weise zugeführt. Darüber hinaus können serielle Infektionen untersucht werden durch die Larve zu einem Erreger zunächst auszusetzen, wie beschrieben, und dann die Übertragung der Tiere auf eine ne...

C. Elegans hat seit mehr als 50 Jahren als leistungsstarke Modellorganismus eingesetzt. In den 1960er Jahren Pionier südafrikanischer Biologe Sydney Brenner im Einsatz von C. Elegans , neuronale Entwicklung zu studieren ebnet den Weg für eine lange Linie von Wissenschaftlern, verschiedene Aspekte der Zell- und Biologie in Nematoden zu studieren. Diese Linie umfasst Nobelpreisträger Craig Mello und Andrew Fire für ihre RNAi Arbeit1, Robert Horvitz und John Sulston für ihre Arbeit über die Organentwicklung und Apoptose2,3,4, und Martin Chalfie für seine Arbeiten über grün fluoreszierendes Protein5. Obwohl diese Modellorganismus traditionell verwendet wurde, um Entwicklungsstörungen Molekularbiologie, in den vergangenen 15 Jahren zu studieren, haben Forscher damit begonnen, C. Elegans zu verwenden, um die Biologie der verschiedenen menschlichen Krankheitserreger einschließlich Pseudomonas untersuchen Aeruginosa, Staphylococcus Aureus, Salmonellen Entericaund Serratia Marcescens6,7,8,9,10. Diese Studien zeigten, dass viele der Mechanismen der Interaktion Mensch-Erreger beteiligt sind konserviert in Nematoden, aber auch das gibt es einige Immunität-Mechanismen, die einzigartig für dieses Modell Organismus11,12. In der Natur C. Elegans Begegnungen einer Vielzahl von Bedrohungen aus aufgenommenen Krankheitserreger im Boden vorhanden, und dies hat einen starken Selektionsdruck zu entwickeln und zu pflegen eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem in seiner Darmlumen zur Verfügung gestellt. Viele der Gene und Mechanismen, die im Bereich des Darmlumens werden durch hoch konserviert Elemente orchestriert, die gibt es auch in höheren Säugetiere11,13. C. Elegans stellt daher ein großes Modell, Magen-Darm-Erreger wie Salmonella Enterica14, Shigella Boydii15oder Vibrio Cholera16zu studieren.
Hier heben wir die bemerkenswerte Vielseitigkeit von C. Elegans als Modell Host Infektionserreger wie C. Albicanszu studieren. C. Elegans als Modell Host ermöglicht Hochdurchsatz-Screening für Virulenz, das ist weniger teuer und zeitaufwändig als ein Mausmodell, das häufig verwendet wird, um Candidiasis42zu studieren.
In dieser Studie zeigen wir, dass dieses Modell und ihre überleben Assay zuverlässig genutzt werden können, für das Studium Host angeborenen Immunsystem Effektoren wichtig gegen Infektionen, Erreger Determinanten, die Virulenz, fahren und pharmakologischen Verbindungen können in Pathogenese eingreifen. Ähnlich wie zuvor beschriebenen Tests diese Methode bietet eine Möglichkeit des Studiums Exposition gegenüber einem Krankheitserreger über die gesamte Lebensdauer des Tieres, vom Larvenstadium bis ins Erwachsenenalter, anstatt nur Erwachsenenalter bis Tod43,44. Zusammenfassend unsere C. Elegans - ist C. Albicans -Modell ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet werden kann, nicht nur die genetischen Grundlagen zu studieren, die Infektion und Immunität zu fahren, sondern auch neue Verbindungen für eine therapeutische Intervention zu identifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Wir zeigen eine Methode mit Caenorhabditis Elegans als Modell Host, um mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren. Mikroben sind über die Ernährung machen dem Darm den primären Speicherort für die Krankheit eingeführt. Die Nematoden Darm strukturell und funktionell imitiert Säugetier-Darm und ist transparent macht es zugänglich für mikroskopische Untersuchung von Besiedlung. Hier zeigen wir, dass Krankheitserreger Krankheit und zum Tod führen können. Wir sind in der Lage, mikrobielle Mutanten zu identifizieren, die veränderten Virulenz zu zeigen. Seine erhaltenen angeborene Reaktion auf biotische betont macht C. Elegans ein ausgezeichnetes System Facetten des angeborenen Immunsystems Wirt Interaktionen zu untersuchen. Wir zeigen, dass Hosts mit Mutationen im gen duale Oxidase nicht reaktiven Sauerstoffspezies produzieren und sind nicht in der Lage, mikrobielle Beleidigung zu widerstehen. Weiter zeigen wir die Vielseitigkeit des vorgestellten überleben Tests zeigen, dass es zur Untersuchung der Auswirkungen von Inhibitoren des mikrobiellen Wachstums verwendet werden kann. Dieser Test kann auch verwendet werden, entdecken Pilz Virulenzfaktoren als Ziele für die Entwicklung von neuartigen Antimykotika, sowie bieten die Möglichkeit, weitere Host-Mikroben-Interaktionen aufzudecken. Das Design dieser Assay eignet sich gut für hohen Durchsatz Vollständiggenom Bildschirme, während die Fähigkeit, Cryo-Konserve Würmer für zukünftigen Gebrauch es eine kostengünstige und attraktive ganze Tiermodell macht zu studieren.

Eine Pathogenese-Assay (Abb. 1) mit C. Albicans und C. Elegans wurde zuvor von unserem Labor17,18 und andere Labors19,20beschrieben. Wir zeigen die Bereitschaft der Verwendung von C. Elegans , um C. Albicans Virulenz zeigen, dass C. Albicans Zellen von den Würmern schnell aufgenommen werden und rei...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

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Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

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Serie: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipulation der Diploidie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine in bakteriellen Konjugation

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Manipulation der Diploidie in Caenorhabditis elegans

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

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Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Manipulation der Diploidie in Caenorhabditis elegans

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

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In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine in bakteriellen Konjugation