Name: the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

Bu eser gerçekleştirilen ve Worcester Polytechnic Enstitüsü tarafından desteklenen.

1. Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) hazırlık <ol><li>için 1 L medya, 20 g agar, 2.5 g organik azot kaynağı (örneğin, bacto-pepton) ve 3 g sodyum klorür bir 2 L şişesi içinde birleştirmek. 975 mL steril su ekle.
	<ol><li>Ekle bir steril heyecan barda. Bir otomatik medya dökücü, otoklav boru ve medya 15dk için kullanıyorsanız; medya-meli var olmak autoclaved için artık daha fazla yapılırsa.</li>
	</ol></li> <li>Ayarla medya heyecan plaka üzerinde ve soğumasını bekleyin.
	<ol><li>Medya (yaklaşık 60 ° C) aseptik dokunmak sıcak olduğunda 1 M MgSO 4 1 mL ekleyin &#9679; H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, KPO 4 25 mL ve 1 mL etanol içinde % 0.5 kolesterol.</li>
		<li>Medya (el ile veya otomatik pompa) laminar akış altında 35 mm x 10 mm steril petri yemekler dökün. 1-2 gün kullanmadan önce başlık altında kurumasını izin. 
		Not: Tabak kontaminasyonu önlemek için 4 ° C saklanmalıdır.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bir solucan almak yapım <ol><li>bir 1,5 cm parça Alüminyum tel kesme. Dikkatle bu uzunluğu yaklaşık 0.5 cm Pasteur pipet ucu takın.
	<ol><li>Bir Bunsen brülör veya alkol lamba, kullanarak Tel güvenli bir şekilde pipet pipet ucu orijinal şekli ödün vermeden yapıştırılır kadar yavaş yavaş alev içinde döndürerek cam pipet ucu eritebilir.</li>
	</ol></li></ol> 3. E. coli kültür hazırlanması <ol><li>bir kısır döngü kullanarak, koloni E. coli baskı OP50 Luria suyu 200 ml aşılamak. Gecede 37, sallayarak ile kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Sıvı kültür ertesi gün kullanıma hazırdır ve kullanılmadığı zaman 4 ° C'de depolanmış olabilir. 
	Not: E. coli gerginliği, OP50, için bir besin kaynağı olarak kullanılan C. elegans. Bu kültür için kullanılabilir birkaç ay 4'te saklandığında kadar ° C.</li>
</ol> 4. Temel C. elegans bakım <ol><li>NGM Ağar kaplamalar E. coli ile yaklaşık 50-100 µL hazırlanan OP50 sıvı kültür plaka Merkezi lekelenme tarafından hazırlanan tohum.</li>
	<li>Kuruyucu ve onları, oda sıcaklığında 24 h için kurumasını bekleyin. Sonra kuru, hızlı büyüme için gecede 37 ° C'de tabak yerleştirin veya daha yavaş büyüme isterseniz oda sıcaklığında tutun.</li>
	<li>Ekleyin solucanlar plakasına tarafından &#34; parçalama, &#34; (bkz: protokol adım 5 &#34; Chunking ve malzeme çekme solucanlar &#34;), solucanlar tek tek seçmek veya solucan yumurta doğrudan plaka üzerine yerleştirerek (bkz: protokol adım 6 &#34; yumurta hazırlık &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking ve solucanlar toplama Not: &#34; parçalama, &#34; C. elegans bakım ortak bir uygulama anlamına gelir. Bu bir bölüm solucan içeren NGM agar plaka kesme ve bu parça yeni bir tabak üzerine aktarılması, böylece aynı zamanda aktarılması sürecinde solucanlar, çok sayıda içerir. Kirlenme plaka bu şekilde dışarı kesebilir. Solucanlar seçilmesinde, solucanlar agar boşluklar kayıp olabilir çünkü agar bütünlüğünü korumak önemlidir. Buna ek olarak, agar erime veya solucanlar yanma önlemek için plaka dokunmadan önce soğuması çekme izin önemlidir.
<ol>Hızlı bir şekilde solucanlar yeni Kaplamalar, üzerine büyük miktarlarda aktarmak için <li>bir spatula kullanarak seçili solucan içeren NGM agar bir parça kesti. Kesilmiş parça çıkarın ve yüz aşağı OP50 çimenlerin üzerine yeni bir tabak kenarına yerleştirin.</li>
	<li>Transfer protokolü adım 8.2, aşağıda açıklandığı gibi ayrı ayrı solucanlar &#34; hayatta kalma yöntemi, &#34; bir solucan kullanarak seçin. Alev solucan Tel al kırmızı olana. Alev çıkarın ve birkaç saniye için soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Tel çekme üzerinde kullanarak yavaşça tel çekme üzerinde kapsayan yeni plaka üzerinde yetiştirilen OP50 kültür çim kazımak.</li>
	<li>Tel ucu kapsayan viskoz kültür sopa çekmeyi ucuna, böylece nazikçe bir sürükleme hareketi kullanarak seçili solucanlar kadar aç kurt yapar.</li>
	Bir kez seçilen solucanlar toplandık, <li>koyun onları yeni bir tabağa nazikçe kültür agar swiping tarafından. Tel çekme üzerinde kalan kültür kaldırmak için alevin içine yerleştirin.</li>
</ol> 6. Yumurta hazırlık <ol><li>toplama ya da 5, protokolü adımda anlatıldığı gibi parçalama tarafından yaklaşık 20 Yetişkin Hayvanlar (yaklaşık 2-3 gün sonra 20 ° C'de yetiştirilen damızlık) yer &#34; Chunking ve solucanlar, malzeme çekme &#34; ile 50 numaralı seribaşı bir plaka üzerine E. coli baskı, OP50 µL.</li>
	<li>Yumurta toplamak için sel M9 arabellek 10 mL ile plaka 1-2 gün sonra. Bir cam serolojik pipet kullanarak, girdap ve yavaşça yumurta şaşırıp kalmış OP50 ya da Yetişkin Hayvanlar serbest bırakmak için agar plaka üzerinde içeriği tahrik. Yumurta ve yetişkin içeren sıvı toplamak.</li>
	<li>15 mL konik M9 transfer ve OP50 çözümde tüp. Santrifüj kapasitesi 2100 x g 2 dakika süreyle de 15 mL konik tüp</li>
	<li>Yaklaşık 9 mL süpernatant OP50 Pelet bozmadan Aspire edin.</li>
	<li>2 mL steril su, çamaşır suyu 1 mL ve 1 mL 0.25 M NaOH Pelet resuspend.</li>
	Yetişkin Hayvanlar (yaklaşık yüzde 70) çoğunluğu lysed görününceye kadar <li>karışımı yavaşça tarafından inversiyon; genellikle, yumurta bu kısa çamaşır suyu tedavi sırasında kendi kabuk nedeniyle korunacak. Konik tüp, 990 x g 2 dakika süreyle santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Pelet bozmadan aspiratı süpernatant. Pelet 10 mL M9 arabellek yeniden askıya alma.</li>
	<li>990 x g 2 dk. aspiratı süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet için konik tüp santrifüj kapasitesi. M9 arabelleği 200 µL ile yeniden askıya Pelet. 
	Not: Birden fazla denemeler yumurta hazırlık gerektirebilir. Onlar uzun süre bleach maruz kalır Eğer yumurta yok olabilir. Yumurtadan değil, çamaşır suyu çözüm konsantrasyonu azaltmak veya çamaşır suyu pozlama süresi azaltmak.</li>
</ol> 7. Enfeksiyon plaka koymak-yukarıya <ol><li>YPD 3-5 mL steril tüp içine dağıtmak ve bir kısır döngü kullanarak Candida albicans bir koloni ile aşılamak.
	<ol><li>Yaklaşık 16-18 h 30 için çevirme davul tüpü yerleştirin ° C.</li>
	</ol></li> <li>C. albicans ve başka OP50 içerecek şekilde içerecek şekilde etiket bir 1.5 mL microfuge tüp. Her boş tüpün ağırlığı kaydetmek.
	<ol><li>Yer 500 µL gecede C. albicans kültür tüp içine etiketli C. albicans ve gecede OP50 kültür (Kimden adım 3.1) 1.500 µL OP50 etiketli tüpüne.</li>
		<li>, 16,100 g. aspiratı süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet x 10 dk santrifüj.</li>
		<li>Her Pelet 500 µL steril su ile yeniden askıya alma. Santrifüj 16,100 x g., 5 min için</li>
		<li>Pelet bozmadan aspiratı süpernatant. Microfuge tüpler son ağırlığı kaydetmek.</li>
		<li>Microfuge tüpler son ağırlık üzerinden ilk ağırlığını çıkararak her Pelet ağırlığını belirlemek.</li>
	</ol></li> <li>Steril su kullanarak yeniden askıya C. albicans Pelet 10 mg/ml ve 200 mg/ml OP50 Pelet. Streptomisin, 50 mg/mL solüsyon 10 µL, OP50 kültürünün 2.5 µL, 0.5 µL C. albicans kültür ve steril su 7 µL birleştirerek karışımı bir ana enfeksiyon olun.
	<ol><li>C. albicans kültür hacmi steril su ile değiştirerek kontrol levha için ana bir karışım oluşturmak. Enfeksiyon karışımı veya OP50 kontrol çözümü bir micropipette kullanarak Merkezi NGM plakalar üzerine 20 µL tohum. 
		Not: Yaklaşık 100 solucanlar istatistiksel anlamlılık Çözümleme sırasında belirlemek için gereklidir. Bu tahlil genellikle nüsha çalıştırılır. Böylece, 3.2 x enfeksiyon mix yanı sıra 3.2 x kontrol çözümü yapılır. Bu karışımları biraz üzerinde 3 x tam 20 µL üzerine hata izin her plaka numaralı seribaşı sağlamak için orijinal olmak için yapılır. Yutak solucanın ilk larva evrelerinde (L1-L3) C. albicans tüketmek için çok küçük olduğundan bu ana karışımı oluşturulur. Flukonazol kullanımı ( şekil 3B) gibi farmakolojik ajanlara maruz kalma için enfeksiyon karışıma aracı kullanılmaya başlandı. Aracı konsantrasyonu ampirik olarak belirlenir. Örneğin, içinde şekil 3B, 50 µM Flukonazol temsil edilmektedir, ancak 0, 12.5, 25, 50 ve 100 µM Flukonazol vardı da aynı iletişim kuralını kullanarak test.</li>
	</ol></li></ol> 8. Anal bölge (Dar) deforme fenotip ve hayatta kalma tahlil analiz <ol><li>Visualize Dar fenotip Not: Dar L3 aşamada ve ötesinde en iyi görüntülenir. Dar olan zaman içinde daha belirgin hale gelir solucanın ( şekil 2A), küçük bir çıkıntı sonrası anal bölgede olarak gözlenmektedir.
	<ol><li>Bir hayvan olup olmadığını hızlı bir şekilde plaka diseksiyon mikroskop sahneye dokunarak Dar; Dar hayvanlarla-ecek da lüzum hemen geriye doğru hareket hayvan Dar olmadan Onayla kendi yönünü ya da tersine çevirmek için dokunarak tur tekrarlanan Bunu hiç yapmak.</li>
	</ol></li> <li>Hayatta kalma tahlil <ol><li>daha önce protokol adım 6, açıklandığı gibi tam yumurta hazırlık &#34; yumurta hazırlık &#34;. Diseksiyon kapsamı altında yumurta sayısı ve yaklaşık 5-6 sağlıklı yumurta µL başına bir konsantrasyon elde kadar M9 yumurta Çözümle sulandırmak. Bir pipet kullanarak dağıtmak arasında yaşayan bakteri kültürü ve plaka tarafında hazırlanan NGM plaka üzerine yaklaşık 30 yumurta içeren 20 µL örnek (yumurta ve solucan yemek, OP50, iki farklı noktalar vardır).</li>
		<li>İçin 48 h 20 ° C'de Incubate tabaklar. Diseksiyon mikroskop altında canlı ve ölü yetişkin solucanlar her plaka üzerinde sayısı, hem de Dar Kurtlarla sayısını saymak. Dar ile yüzde rekor.</li>
		<li>Kafasına bir Alüminyum tel veya dokunarak plaka için dinleniyor vermezse bir hayvan ölü düşünün.</li>
		<li>Her gün, aktarım kalan yetişkin solucanlar tarafından malzeme çekme 5, protokolü adımda anlatıldığı gibi &#34; Chunking ve solucanlar, malzeme çekme &#34; yeni bir enfeksiyon veya kontrol levha üzerine. Bu noktada, canlı, ölü ve kayıp solucanlar sayısı her gün takip ederek bir hayatta kalma tahlil gerekirse, gerçekleştirmek. 
		Not: Bu tahlil yumurta hazırlık ile başlayan iki hafta boyunca çalıştırabilirsiniz. Çözüm OP50 öldürebilir çamaşır suyu izleri içerebilir gibi Ayrıca, yumurta çözüm bakteri kültürü reçete değil. Çözüm Ayrıca olmalıdır yumurta plaka ve agar kenarlarına arasında kalmış olur gibi yaklaşık 0.5 cm tabak kenarına uzakta reçete. Buna ek olarak, solucanlar hızlı yayılması nedeniyle, Yetişkin yeni plakalar üzerine aktarma onları--dan onların döl ayırmak için çok önemlidir.</li>
	</ol></li> <li>Analiz hayatta kalma <ol><li>sağkalım eğrisi analiz yazılımı kullanarak sonuçları analiz (malzeme listesi için bakınız).</li>
		Grehan-Breslow-Wilcoxon yöntemini kullanarak <li>Karşılaştır hayatta kalma eğrileri (veri buna göre erken hayatta kalma kez verilerden ilerleyen zamanlarda daha doğru olduğu varsayımıyla, ağırlığı) yanı sıra Logrank istatistiksel araçlar 45. 
		Not: Örneğin, içinde şekil 4B -C, mutant C. albicans ile tedavi solucanlar yaşama isogenic vahşi tipi denetimleri veya complementarystrains ile tedavi karşılaştırılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz anlatmıştık C. albicans maruz ömür boyu üzerinde C. elegans enfeksiyon ve hayatta kalma raporlaması için yöntemler başka bir patojen sınamak için değiştirilebilir. Başka bir bakteri veya mantar sıvı kültürleri yapılmış ve C. elegans için benzer bir şekilde beslenir. Ayrıca, seri enfeksiyonlar denetlesinler ilk larva bir patojen için açıklandığı gibi göstererek ve sonra hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra ayrı bir patojen içeren yeni bir plaka üzerine...

C. elegans 50 yıldan fazla bir güçlü model organizma kullanılmıştır. 1960'larda, Güney Afrikalı biyolog Sydney Brenner hücre ve hayvan biyolojisi nematodlar içinde çeşitli yönlerini incelemek için uzun bir soy bilim adamlarının önünü nöronal gelişim, eğitim için C. elegans kullanılmasına öncülük etmiştir. Bu soy Nobel Ödülü sahipleri Craig Mello ve Andrew Fire onların RNAi iş1için Robert Horvitz ve John Sulston organ gelişimi ve Apoptozis2,3,4onların çalışmaları için ve Martin Chalfie içerir Yeşil flüoresan protein5üzerine çalışmaları için. Bu model organizma geleneksel olarak son 15 yılda biyoloji, moleküler ve gelişimsel çalışmaya yolculuklarında uygulanmış olsa, araştırmacılar Biyoloji Pseudomonas dahil olmak üzere çeşitli insan patojenlerin araştırmak için C. elegans kullanmaya başladı aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericave Serratia marcescens6,7,8,9,10. Bu çalışmalar birçok insan-patojen etkileşimde yer alan ilgili mekanizmaların korunmuş ortaya nematodlar de, ama bu bu model organizma11,12' ye özgü bazı bağışıklık mekanizmaları vardır. Doğada, C. elegans tehditlerine karşı alınan patojenler toprakta mevcut çeşitli karşılaşır ve bu gelişmeye ve onun intestinal Lümen sofistike bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi korumak için güçlü bir seçici basınç sağlamıştır. Genler ve mekanizmaları intestinal Lümen korunması dahil çoğu aynı zamanda daha yüksek memeliler11,13' te var son derece korunmuş öğeler tarafından düzenledi. C. elegans bu nedenle Salmonella enterica14, Shigella boydii15veya kolera16gibi gastrointestinal patojenler çalışmaya büyük bir model temsil eder.
Burada biz C. elegans olağanüstü çok yönlü C. albicansgibi enfeksiyöz ajanlar çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak vurgulayın. C. elegans modeli ana bilgisayar olarak daha az pahalı ve zaman alıcı kandidiyazis42eğitim için yaygın olarak kullanılan bir fare modeli daha virülans için yüksek aktarım tarama sağlar.
Bu çalışmada, biz bu modeli ve assosiated hayatta kalma tahlil güvenilir ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık effectors enfeksiyonlar, virülans, sürücü patojen belirleyicileri karşı koymak önemli eğitim için kullanılabileceğini gösterir ve farmakolojik olabilir maddeler ve birleşimler patogenezinde müdahale. Yukarıda açıklanan deneyleri için birbirine benzemeyen, bu yöntem maruz kalma bir patojen hayvan sadece yetişkinlik yerine, yetişkinlik larva Sahne Alanı'ndan ölüm43,44ömrünü üzerinden eğitim için bir yol sağlar. Özet olarak, bizim C. elegans - sadece sürücü enfeksiyon ve bağışıklık genetik üsleri eğitim için aynı zamanda yeni bileşenleri, terapötik müdahale için tanımlamak için kullanılan çok yönlü ve güçlü bir araç C. albicans modelidir.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Biz Caenorhabditis elegans mikrobiyal etkileşim çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak kullanarak bir yöntem göstermek. Mikroplar bağırsak hastalığı için birincil konumunu yaparak diyet ile tanıtılmaktadır. Nematot bağırsak yapısal ve işlevsel olarak memeli bağırsak taklit ve yapım o mükellef kolonizasyon mikroskobik incelenmesi için saydamdır. İşte patojenler hastalık ve ölüm neden olabilir göstermektedir. Değiştirilmiş virülans göstermek mikrobiyal mutantlar tespit edebiliyoruz. Biyotik streslere korunmuş onun doğuştan gelen yanıt C. elegans ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık etkileşimleri yönleriyle araştırmak için mükemmel bir sistem yapar. Gösterdiğimiz ev sahipliği yapan çift oksidaz gen mutasyonları ile Reaktif oksijen türleri üretemez ve mikrobiyal hakaret direnmek mümkün değildir. Daha fazla çok yönlülük sunulan hayatta kalma testin inhibitörlerinin mikrobiyal büyüme etkileri çalışma için kullanılabilir göstererek göstermektedir. Bu tahlil yanı sıra roman antifungal ajanların gelişim için hedefler olarak mantar virülans faktörleri keşfetmek daha fazla ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri ortaya çıkarmak için bir fırsat sağlamak için de kullanılabilir. Cryo-koru solucanlar ileride kullanmak için yetenek çalışmak için bir maliyet-etkin ve çekici bütün hayvan modeli yapar iken bu tahlil tasarımını de yüksek üretilen iş için bütün-genom ekranlar, ödünç vermek kendisi.

C. albicans ve C. elegans kullanarak bir Patogenez tahlil (şekil 1) daha önce bizim laboratuvar17,18 ve diğer labs19,20tarafından tarif edilmiştir. C. albicans hücreleri hızlı bir şekilde solucanlar tarafından yutulur ve yavaş hareket, neden intestinal Lümen içinde birikir gösterilen C. albicans</em...

Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Video: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>C. Albicans'ta Ölümcül Olmayan Virülans Fenotiplerini İncelemek İçin İki Enfeksiyon Testi C. elegans Kullanılarak

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

C. Albicans'ta Ölümcül Olmayan Virülans Fenotiplerini İncelemek İçin İki Enfeksiyon Testi C. elegans Kullanılarak

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Genetik

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Biyoloji

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

C. Albicans'ta Ölümcül Olmayan Virülans Fenotiplerini İncelemek İçin İki Enfeksiyon Testi C. elegans Kullanılarak

C. Albicans'ta Ölümcül Olmayan Virülans Fenotiplerini İncelemek İçin İki Enfeksiyon Testi C. elegans Kullanılarak

Otomatik Ayırma

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

Bağırsak Mikrobiyom Bakterileri İçin Zenginleştirmek için Yabani Caenorhabditis Nematodlarının Seçici Temizliği

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Model Nematod Caenorhabditis elegans'ın Doğal Mikrobiyotasının İzolasyonu ve Karakterizasyonu