Bu eser gerçekleştirilen ve Worcester Polytechnic Enstitüsü tarafından desteklenen.

1. Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) hazırlık <ol><li>için 1 L medya, 20 g agar, 2.5 g organik azot kaynağı (örneğin, bacto-pepton) ve 3 g sodyum klorür bir 2 L şişesi içinde birleştirmek. 975 mL steril su ekle.
	<ol><li>Ekle bir steril heyecan barda. Bir otomatik medya dökücü, otoklav boru ve medya 15dk için kullanıyorsanız; medya-meli var olmak autoclaved için artık daha fazla yapılırsa.</li>
	</ol></li> <li>Ayarla medya heyecan plaka üzerinde ve soğumasını bekleyin.
	<ol><li>Medya (yaklaşık 60 ° C) aseptik dokunmak sıcak olduğunda 1 M MgSO 4 1 mL ekleyin &#9679; H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2, KPO 4 25 mL ve 1 mL etanol içinde % 0.5 kolesterol.</li>
		<li>Medya (el ile veya otomatik pompa) laminar akış altında 35 mm x 10 mm steril petri yemekler dökün. 1-2 gün kullanmadan önce başlık altında kurumasını izin. 
		Not: Tabak kontaminasyonu önlemek için 4 ° C saklanmalıdır.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bir solucan almak yapım <ol><li>bir 1,5 cm parça Alüminyum tel kesme. Dikkatle bu uzunluğu yaklaşık 0.5 cm Pasteur pipet ucu takın.
	<ol><li>Bir Bunsen brülör veya alkol lamba, kullanarak Tel güvenli bir şekilde pipet pipet ucu orijinal şekli ödün vermeden yapıştırılır kadar yavaş yavaş alev içinde döndürerek cam pipet ucu eritebilir.</li>
	</ol></li></ol> 3. E. coli kültür hazırlanması <ol><li>bir kısır döngü kullanarak, koloni E. coli baskı OP50 Luria suyu 200 ml aşılamak. Gecede 37, sallayarak ile kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Sıvı kültür ertesi gün kullanıma hazırdır ve kullanılmadığı zaman 4 ° C'de depolanmış olabilir. 
	Not: E. coli gerginliği, OP50, için bir besin kaynağı olarak kullanılan C. elegans. Bu kültür için kullanılabilir birkaç ay 4'te saklandığında kadar ° C.</li>
</ol> 4. Temel C. elegans bakım <ol><li>NGM Ağar kaplamalar E. coli ile yaklaşık 50-100 µL hazırlanan OP50 sıvı kültür plaka Merkezi lekelenme tarafından hazırlanan tohum.</li>
	<li>Kuruyucu ve onları, oda sıcaklığında 24 h için kurumasını bekleyin. Sonra kuru, hızlı büyüme için gecede 37 ° C'de tabak yerleştirin veya daha yavaş büyüme isterseniz oda sıcaklığında tutun.</li>
	<li>Ekleyin solucanlar plakasına tarafından &#34; parçalama, &#34; (bkz: protokol adım 5 &#34; Chunking ve malzeme çekme solucanlar &#34;), solucanlar tek tek seçmek veya solucan yumurta doğrudan plaka üzerine yerleştirerek (bkz: protokol adım 6 &#34; yumurta hazırlık &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking ve solucanlar toplama Not: &#34; parçalama, &#34; C. elegans bakım ortak bir uygulama anlamına gelir. Bu bir bölüm solucan içeren NGM agar plaka kesme ve bu parça yeni bir tabak üzerine aktarılması, böylece aynı zamanda aktarılması sürecinde solucanlar, çok sayıda içerir. Kirlenme plaka bu şekilde dışarı kesebilir. Solucanlar seçilmesinde, solucanlar agar boşluklar kayıp olabilir çünkü agar bütünlüğünü korumak önemlidir. Buna ek olarak, agar erime veya solucanlar yanma önlemek için plaka dokunmadan önce soğuması çekme izin önemlidir.
<ol>Hızlı bir şekilde solucanlar yeni Kaplamalar, üzerine büyük miktarlarda aktarmak için <li>bir spatula kullanarak seçili solucan içeren NGM agar bir parça kesti. Kesilmiş parça çıkarın ve yüz aşağı OP50 çimenlerin üzerine yeni bir tabak kenarına yerleştirin.</li>
	<li>Transfer protokolü adım 8.2, aşağıda açıklandığı gibi ayrı ayrı solucanlar &#34; hayatta kalma yöntemi, &#34; bir solucan kullanarak seçin. Alev solucan Tel al kırmızı olana. Alev çıkarın ve birkaç saniye için soğumasını bekleyin.</li>
	<li>Tel çekme üzerinde kullanarak yavaşça tel çekme üzerinde kapsayan yeni plaka üzerinde yetiştirilen OP50 kültür çim kazımak.</li>
	<li>Tel ucu kapsayan viskoz kültür sopa çekmeyi ucuna, böylece nazikçe bir sürükleme hareketi kullanarak seçili solucanlar kadar aç kurt yapar.</li>
	Bir kez seçilen solucanlar toplandık, <li>koyun onları yeni bir tabağa nazikçe kültür agar swiping tarafından. Tel çekme üzerinde kalan kültür kaldırmak için alevin içine yerleştirin.</li>
</ol> 6. Yumurta hazırlık <ol><li>toplama ya da 5, protokolü adımda anlatıldığı gibi parçalama tarafından yaklaşık 20 Yetişkin Hayvanlar (yaklaşık 2-3 gün sonra 20 ° C'de yetiştirilen damızlık) yer &#34; Chunking ve solucanlar, malzeme çekme &#34; ile 50 numaralı seribaşı bir plaka üzerine E. coli baskı, OP50 µL.</li>
	<li>Yumurta toplamak için sel M9 arabellek 10 mL ile plaka 1-2 gün sonra. Bir cam serolojik pipet kullanarak, girdap ve yavaşça yumurta şaşırıp kalmış OP50 ya da Yetişkin Hayvanlar serbest bırakmak için agar plaka üzerinde içeriği tahrik. Yumurta ve yetişkin içeren sıvı toplamak.</li>
	<li>15 mL konik M9 transfer ve OP50 çözümde tüp. Santrifüj kapasitesi 2100 x g 2 dakika süreyle de 15 mL konik tüp</li>
	<li>Yaklaşık 9 mL süpernatant OP50 Pelet bozmadan Aspire edin.</li>
	<li>2 mL steril su, çamaşır suyu 1 mL ve 1 mL 0.25 M NaOH Pelet resuspend.</li>
	Yetişkin Hayvanlar (yaklaşık yüzde 70) çoğunluğu lysed görününceye kadar <li>karışımı yavaşça tarafından inversiyon; genellikle, yumurta bu kısa çamaşır suyu tedavi sırasında kendi kabuk nedeniyle korunacak. Konik tüp, 990 x g 2 dakika süreyle santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Pelet bozmadan aspiratı süpernatant. Pelet 10 mL M9 arabellek yeniden askıya alma.</li>
	<li>990 x g 2 dk. aspiratı süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet için konik tüp santrifüj kapasitesi. M9 arabelleği 200 µL ile yeniden askıya Pelet. 
	Not: Birden fazla denemeler yumurta hazırlık gerektirebilir. Onlar uzun süre bleach maruz kalır Eğer yumurta yok olabilir. Yumurtadan değil, çamaşır suyu çözüm konsantrasyonu azaltmak veya çamaşır suyu pozlama süresi azaltmak.</li>
</ol> 7. Enfeksiyon plaka koymak-yukarıya <ol><li>YPD 3-5 mL steril tüp içine dağıtmak ve bir kısır döngü kullanarak Candida albicans bir koloni ile aşılamak.
	<ol><li>Yaklaşık 16-18 h 30 için çevirme davul tüpü yerleştirin ° C.</li>
	</ol></li> <li>C. albicans ve başka OP50 içerecek şekilde içerecek şekilde etiket bir 1.5 mL microfuge tüp. Her boş tüpün ağırlığı kaydetmek.
	<ol><li>Yer 500 µL gecede C. albicans kültür tüp içine etiketli C. albicans ve gecede OP50 kültür (Kimden adım 3.1) 1.500 µL OP50 etiketli tüpüne.</li>
		<li>, 16,100 g. aspiratı süpernatant olmadan rahatsız edici Pelet x 10 dk santrifüj.</li>
		<li>Her Pelet 500 µL steril su ile yeniden askıya alma. Santrifüj 16,100 x g., 5 min için</li>
		<li>Pelet bozmadan aspiratı süpernatant. Microfuge tüpler son ağırlığı kaydetmek.</li>
		<li>Microfuge tüpler son ağırlık üzerinden ilk ağırlığını çıkararak her Pelet ağırlığını belirlemek.</li>
	</ol></li> <li>Steril su kullanarak yeniden askıya C. albicans Pelet 10 mg/ml ve 200 mg/ml OP50 Pelet. Streptomisin, 50 mg/mL solüsyon 10 µL, OP50 kültürünün 2.5 µL, 0.5 µL C. albicans kültür ve steril su 7 µL birleştirerek karışımı bir ana enfeksiyon olun.
	<ol><li>C. albicans kültür hacmi steril su ile değiştirerek kontrol levha için ana bir karışım oluşturmak. Enfeksiyon karışımı veya OP50 kontrol çözümü bir micropipette kullanarak Merkezi NGM plakalar üzerine 20 µL tohum. 
		Not: Yaklaşık 100 solucanlar istatistiksel anlamlılık Çözümleme sırasında belirlemek için gereklidir. Bu tahlil genellikle nüsha çalıştırılır. Böylece, 3.2 x enfeksiyon mix yanı sıra 3.2 x kontrol çözümü yapılır. Bu karışımları biraz üzerinde 3 x tam 20 µL üzerine hata izin her plaka numaralı seribaşı sağlamak için orijinal olmak için yapılır. Yutak solucanın ilk larva evrelerinde (L1-L3) C. albicans tüketmek için çok küçük olduğundan bu ana karışımı oluşturulur. Flukonazol kullanımı ( şekil 3B) gibi farmakolojik ajanlara maruz kalma için enfeksiyon karışıma aracı kullanılmaya başlandı. Aracı konsantrasyonu ampirik olarak belirlenir. Örneğin, içinde şekil 3B, 50 µM Flukonazol temsil edilmektedir, ancak 0, 12.5, 25, 50 ve 100 µM Flukonazol vardı da aynı iletişim kuralını kullanarak test.</li>
	</ol></li></ol> 8. Anal bölge (Dar) deforme fenotip ve hayatta kalma tahlil analiz <ol><li>Visualize Dar fenotip Not: Dar L3 aşamada ve ötesinde en iyi görüntülenir. Dar olan zaman içinde daha belirgin hale gelir solucanın ( şekil 2A), küçük bir çıkıntı sonrası anal bölgede olarak gözlenmektedir.
	<ol><li>Bir hayvan olup olmadığını hızlı bir şekilde plaka diseksiyon mikroskop sahneye dokunarak Dar; Dar hayvanlarla-ecek da lüzum hemen geriye doğru hareket hayvan Dar olmadan Onayla kendi yönünü ya da tersine çevirmek için dokunarak tur tekrarlanan Bunu hiç yapmak.</li>
	</ol></li> <li>Hayatta kalma tahlil <ol><li>daha önce protokol adım 6, açıklandığı gibi tam yumurta hazırlık &#34; yumurta hazırlık &#34;. Diseksiyon kapsamı altında yumurta sayısı ve yaklaşık 5-6 sağlıklı yumurta µL başına bir konsantrasyon elde kadar M9 yumurta Çözümle sulandırmak. Bir pipet kullanarak dağıtmak arasında yaşayan bakteri kültürü ve plaka tarafında hazırlanan NGM plaka üzerine yaklaşık 30 yumurta içeren 20 µL örnek (yumurta ve solucan yemek, OP50, iki farklı noktalar vardır).</li>
		<li>İçin 48 h 20 ° C'de Incubate tabaklar. Diseksiyon mikroskop altında canlı ve ölü yetişkin solucanlar her plaka üzerinde sayısı, hem de Dar Kurtlarla sayısını saymak. Dar ile yüzde rekor.</li>
		<li>Kafasına bir Alüminyum tel veya dokunarak plaka için dinleniyor vermezse bir hayvan ölü düşünün.</li>
		<li>Her gün, aktarım kalan yetişkin solucanlar tarafından malzeme çekme 5, protokolü adımda anlatıldığı gibi &#34; Chunking ve solucanlar, malzeme çekme &#34; yeni bir enfeksiyon veya kontrol levha üzerine. Bu noktada, canlı, ölü ve kayıp solucanlar sayısı her gün takip ederek bir hayatta kalma tahlil gerekirse, gerçekleştirmek. 
		Not: Bu tahlil yumurta hazırlık ile başlayan iki hafta boyunca çalıştırabilirsiniz. Çözüm OP50 öldürebilir çamaşır suyu izleri içerebilir gibi Ayrıca, yumurta çözüm bakteri kültürü reçete değil. Çözüm Ayrıca olmalıdır yumurta plaka ve agar kenarlarına arasında kalmış olur gibi yaklaşık 0.5 cm tabak kenarına uzakta reçete. Buna ek olarak, solucanlar hızlı yayılması nedeniyle, Yetişkin yeni plakalar üzerine aktarma onları--dan onların döl ayırmak için çok önemlidir.</li>
	</ol></li> <li>Analiz hayatta kalma <ol><li>sağkalım eğrisi analiz yazılımı kullanarak sonuçları analiz (malzeme listesi için bakınız).</li>
		Grehan-Breslow-Wilcoxon yöntemini kullanarak <li>Karşılaştır hayatta kalma eğrileri (veri buna göre erken hayatta kalma kez verilerden ilerleyen zamanlarda daha doğru olduğu varsayımıyla, ağırlığı) yanı sıra Logrank istatistiksel araçlar 45. 
		Not: Örneğin, içinde şekil 4B -C, mutant C. albicans ile tedavi solucanlar yaşama isogenic vahşi tipi denetimleri veya complementarystrains ile tedavi karşılaştırılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz anlatmıştık C. albicans maruz ömür boyu üzerinde C. elegans enfeksiyon ve hayatta kalma raporlaması için yöntemler başka bir patojen sınamak için değiştirilebilir. Başka bir bakteri veya mantar sıvı kültürleri yapılmış ve C. elegans için benzer bir şekilde beslenir. Ayrıca, seri enfeksiyonlar denetlesinler ilk larva bir patojen için açıklandığı gibi göstererek ve sonra hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra ayrı bir patojen içeren yeni bir plaka üzerine...

C. elegans 50 yıldan fazla bir güçlü model organizma kullanılmıştır. 1960'larda, Güney Afrikalı biyolog Sydney Brenner hücre ve hayvan biyolojisi nematodlar içinde çeşitli yönlerini incelemek için uzun bir soy bilim adamlarının önünü nöronal gelişim, eğitim için C. elegans kullanılmasına öncülük etmiştir. Bu soy Nobel Ödülü sahipleri Craig Mello ve Andrew Fire onların RNAi iş1için Robert Horvitz ve John Sulston organ gelişimi ve Apoptozis2,3,4onların çalışmaları için ve Martin Chalfie içerir Yeşil flüoresan protein5üzerine çalışmaları için. Bu model organizma geleneksel olarak son 15 yılda biyoloji, moleküler ve gelişimsel çalışmaya yolculuklarında uygulanmış olsa, araştırmacılar Biyoloji Pseudomonas dahil olmak üzere çeşitli insan patojenlerin araştırmak için C. elegans kullanmaya başladı aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericave Serratia marcescens6,7,8,9,10. Bu çalışmalar birçok insan-patojen etkileşimde yer alan ilgili mekanizmaların korunmuş ortaya nematodlar de, ama bu bu model organizma11,12' ye özgü bazı bağışıklık mekanizmaları vardır. Doğada, C. elegans tehditlerine karşı alınan patojenler toprakta mevcut çeşitli karşılaşır ve bu gelişmeye ve onun intestinal Lümen sofistike bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi korumak için güçlü bir seçici basınç sağlamıştır. Genler ve mekanizmaları intestinal Lümen korunması dahil çoğu aynı zamanda daha yüksek memeliler11,13' te var son derece korunmuş öğeler tarafından düzenledi. C. elegans bu nedenle Salmonella enterica14, Shigella boydii15veya kolera16gibi gastrointestinal patojenler çalışmaya büyük bir model temsil eder.
Burada biz C. elegans olağanüstü çok yönlü C. albicansgibi enfeksiyöz ajanlar çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak vurgulayın. C. elegans modeli ana bilgisayar olarak daha az pahalı ve zaman alıcı kandidiyazis42eğitim için yaygın olarak kullanılan bir fare modeli daha virülans için yüksek aktarım tarama sağlar.
Bu çalışmada, biz bu modeli ve assosiated hayatta kalma tahlil güvenilir ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık effectors enfeksiyonlar, virülans, sürücü patojen belirleyicileri karşı koymak önemli eğitim için kullanılabileceğini gösterir ve farmakolojik olabilir maddeler ve birleşimler patogenezinde müdahale. Yukarıda açıklanan deneyleri için birbirine benzemeyen, bu yöntem maruz kalma bir patojen hayvan sadece yetişkinlik yerine, yetişkinlik larva Sahne Alanı'ndan ölüm43,44ömrünü üzerinden eğitim için bir yol sağlar. Özet olarak, bizim C. elegans - sadece sürücü enfeksiyon ve bağışıklık genetik üsleri eğitim için aynı zamanda yeni bileşenleri, terapötik müdahale için tanımlamak için kullanılan çok yönlü ve güçlü bir araç C. albicans modelidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>20-248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-1M32P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td>
			<td>Axiovision Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Peptone</td>
			<td>Fisher BioReagants</td>
			<td>BP1420-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans strain Bli-3</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>Bli-3(e767) CB767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP51-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td>
			<td>FIsherBrand</td>
			<td>14-961-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Nikon Instrument Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Miller&#39;s)</td>
			<td>Apex BioResearch Products</td>
			<td>11-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. albicans SC5314</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SC5314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wildtype C. elegans</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Biz Caenorhabditis elegans mikrobiyal etkileşim çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak kullanarak bir yöntem göstermek. Mikroplar bağırsak hastalığı için birincil konumunu yaparak diyet ile tanıtılmaktadır. Nematot bağırsak yapısal ve işlevsel olarak memeli bağırsak taklit ve yapım o mükellef kolonizasyon mikroskobik incelenmesi için saydamdır. İşte patojenler hastalık ve ölüm neden olabilir göstermektedir. Değiştirilmiş virülans göstermek mikrobiyal mutantlar tespit edebiliyoruz. Biyotik streslere korunmuş onun doğuştan gelen yanıt C. elegans ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık etkileşimleri yönleriyle araştırmak için mükemmel bir sistem yapar. Gösterdiğimiz ev sahipliği yapan çift oksidaz gen mutasyonları ile Reaktif oksijen türleri üretemez ve mikrobiyal hakaret direnmek mümkün değildir. Daha fazla çok yönlülük sunulan hayatta kalma testin inhibitörlerinin mikrobiyal büyüme etkileri çalışma için kullanılabilir göstererek göstermektedir. Bu tahlil yanı sıra roman antifungal ajanların gelişim için hedefler olarak mantar virülans faktörleri keşfetmek daha fazla ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri ortaya çıkarmak için bir fırsat sağlamak için de kullanılabilir. Cryo-koru solucanlar ileride kullanmak için yetenek çalışmak için bir maliyet-etkin ve çekici bütün hayvan modeli yapar iken bu tahlil tasarımını de yüksek üretilen iş için bütün-genom ekranlar, ödünç vermek kendisi.

C. albicans ve C. elegans kullanarak bir Patogenez tahlil (şekil 1) daha önce bizim laboratuvar17,18 ve diğer labs19,20tarafından tarif edilmiştir. C. albicans hücreleri hızlı bir şekilde solucanlar tarafından yutulur ve yavaş hareket, neden intestinal Lümen içinde birikir gösterilen C. albicans</em...

Watch this Scientific Journal Video about The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions at JoVE.com

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K Görüntüleme.  Worcester Polytechnic Institute. Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Video: The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Caenorhabditis elegans Ploitlik manipülasyon

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Yineleme kümesi yöntemi: Bir yüksek-den geçerek yaklaşım kantitatif ölçü Caenorhabditis elegans ömrü

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

Büyük Ölçekli Karma Aşama Caenorhabditis Elegans Popülasyonlarının Kültürü ve Tahlilleri

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez