Name: the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
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이 작품에서 수행 하 고 우스터 폴 리 테크닉 연구소에 의해 지원 되었다.

1. 선 충 류 성장 매체 (NGM)의 준비 <ol><li>대 1 L 미디어의 결합 20 g 한 천, 2.5 g 유기 질소 소스 (예:, bacto 펩), 그리고 3 세대 2 L 플라스 크에 염화 나트륨. 메 마른 물 975 mL을 추가.
	<li>추가 메 마른 저 어 바에서 <ol>입니다. 15 분;에 대 한 자동 미디어 pourer, 고압 배관 및 미디어를 사용 하는 경우 미디어 해야 압력가 마로 소독에 대 한 더 이상 높은 볼륨 이루어집니다.</li>
	</ol></li> <li>저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 시원한 수.
	<ol><li>미디어 aseptically (약 60 ° C) 터치 따뜻한 되 면 추가 1 mL의 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL의 1 M CaCl 2, KPO 4, 25 mL 및 에탄올에 0.5% 콜레스테롤의 1 mL.</li>
		<li>붓고 미디어 (손으로 또는 자동 펌프) 층 류에서 35 m m x 10 m m 멸 균 페 트리 디쉬. 사용 하기 전에 1-2 일에 대 한 후드 건조 허용. 
		참고: 접시는 오염을 방지 하기 위해 4 ° C에 저장 되어야 합니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 웜 선택 만들기 <ol><li>알루미늄 와이어의 1.5 cm 조각 잘라. 신중 하 게 파스퇴르 피 펫의 끝에 삽입이 길이 약 0.5 c m.
	<ol><li>천천히 와이어는 안전 하 게 준수는 피 펫 피 펫 팁의 원래 모양에 타협 하지 않고 때까지 불꽃에 회전 하 여 유리 피 펫 팁을 녹여 분 젠 버너 또는 알콜 램프를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 3. 대장균 문화 준비 <ol><li>Luria 국물 200 mL에 대장균 스트레인 OP50의 단일 식민지 접종 메 마른 루프를 사용 하 여. 37에 떨고 함께 밤새 품 어 ° c.</li>
	<li>액체 문화 사용한 다음 날 때 사용 중인 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 
	참고: 대장균 스트레인, OP50를 위한 음식 근원으로 사용 됩니다 C. 선 충. 이 문화에 대 한 사용할 수 있습니다 몇 개월 4에 저장 될 때까지 ° c.</li>
</ol> 4. 필수 C. 선 충 유지 보수 <ol><li>격판덮개의 센터에 준비 된 OP50 액체 문화의 약 50-100 µ L를 안보 여 NGM 대장균과 한 천 배지를 준비 하는 씨.</li>
	<li>접시를 커버 하 고 24 시간 실 온에서 건조 하도록 허용. 일단 건조, 접시 하룻밤 급속 한 성장에 대 한 37 ° C에 또는 느린 성장을 원하는 경우, 실내 온도에 유지.</li>
	<li>중 접시에 벌레를 추가 &#34; 청크, &#34; (프로토콜 단계 5 참조 &#34; 청크와 따기 웜 &#34;), 개별적으로, 벌레를 따기 또는 접시에 직접 웜 계란 배치 (프로토콜 단계 6을 참조 &#34; 계란 준비 &#34;).</li>
</ol> 5. 청크와 따기 웜 참고: &#34; 청크, &#34; C. 선 충 유지 보수에 공통 되는 연습을 말합니다. NGM agar 플레이트 웜, 포함 된 부분의 절단 하 고 또한 많은 과정에서 웜 전송 따라서 새로운 접시에이 조각을 전송, 포함 됩니다. 오염 또한 이와에서 접시에서 절단할 수 있습니다. 벌레를 따기는 agar의 무결성을 유지 하는 벌레는 agar에 구멍에서 손실 될 수 있기 때문에 중요 하다. 또한, 그것은 용 해는 agar 나 벌레를 방지 하기 위해 플레이트를 만지기 전에 냉각 선택 허용 하는 것이 중요.
<ol>많은 양의 새로운 접시에 벌레를 신속 하 게 전송 하려면 <li>NGM agar 주걱을 사용 하 여 선택한 웜 포함의 조각 잘라. 잘라 조각을 제거 하 고 그것에 게 아래로 얼굴을 배치 새로운 접시에 OP50의 잔디밭의 가장자리에.</li>
	<li>전송 프로토콜 단계 8.2에서 아래와 같이 개별적으로 웜 &#34; 생존 분석 결과, &#34; 벌레를 사용 하 여 선택. 때까지 빨간 벌레 선택에 와이어를 불꽃. 불꽃에서 그것을 제거 하 고 그것을 몇 초 동안 냉각 허용.</li>
	<li>선택에 와이어를 다루는 새로운 접시에 성장 하는 OP50 문화의 잔디밭을 긁어 부드럽게, 선택에는 와이어를 사용 하 여.</li>
	<li>점성 문화는 와이어의 끝을 다루는 게 벌레 선택의 끝에 막대기, 따라서 부드럽게 강타해 모션을 사용 하 여 선택한 웜 데리.</li>
	<li>선택한 벌레 수집 되 면 부드럽게는 agar에 걸쳐 문화를 강타해 새로운 접시에 그들을 놓습니다. 장소 선택에 남아 있는 문화를 제거 하는 화 염으로 와이어.</li>
</ol> 6. 계란 준비 <ol><li>따기 또는 청크 프로토콜 5 단계에 설명 된 대로 약 20 성인 동물 (20 ° C에서 성장 될 때 부 화 후 약 2-3 일) 장소 &#34; 청크와 따기 웜, &#34; 50 시드 접시에 E. 콜라가 긴장, OP50의 µ L.</li>
	<li>계란을 수집 하는 1-2 일 후 M9 버퍼의 10 mL와 함께 접시를 홍수. 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 소용돌이 그리고 부드럽게 계란 OP50 또는 성인 동물에 붙어 출시를 한 접시에 내용을 선동. 계란과 성인을 포함 하는 모든 액체를 수집.</li>
	<li>M9 전송 및 OP50 솔루션으로 15 mL 원뿔 튜브. 2100 x g 2 분에 15 mL 원뿔 튜브 원심</li>
	<li>OP50 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한의 약 9 mL를 발음.</li>
	<li>살 균 물 2 mL, 표 백제의 1 mL 및 0.25 M NaOH의 1 mL에 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>Lysed 성인 동물의 대부분 (약 70%)이 나타날 때까지 하는 반전으로 부드럽게 혼합; 일반적으로 계란 그대로 유지이 짧은 표 백제 처리 하는 동안 그들의 포탄 때문에. 990 x g 2 분에 원뿔 튜브 원심</li>
	<li>Aspirate 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고입니다. M9 버퍼의 10 mL에 펠 릿을 다시 중단.</li>
	<li>방해 펠 릿 없이 2 분 Aspirate 상쾌한 990 x g에 원뿔 튜브 원심. M9 버퍼의 200 µ L와 다시 일시 중단 공. 
	참고: 계란 준비 여러 실험 필요할 수 있습니다. 그들은 너무 오래를 위한 표 백제에 노출 된 경우 계란을 파괴 수 있습니다. 알이 부 화 하지 않습니다, 경우 표 백제 솔루션에서의 농도 감소 또는 감소 표 백제에 노출의 기간.</li>
</ol> 7. 감염 플레이트 설정 <ol><li>멸 균 시험관에 YPD의 3-5 mL를 분배 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 칸디 다 albicans에의 한 식민지와 예방.
	<ol><li>약 16-18 h 30에 대 한 회전 드럼에 튜브를 배치 ° c.</li>
	</ol></li> <li>라벨 1 개의 1.5 mL microfuge 관 C. albicans 및 다른 OP50를 포함 포함 하. 각 빈 관의 무게 기록.
	<ol><li>하룻밤 C. albicans 문화 관으로의 장소 500 µ L 표시 된 C. albicans (3.1 단계)에서 하룻밤 OP50 문화의 1500 µ L OP50를 표시 하는 튜브에.</li>
		<li>16100 g. Aspirate 상쾌한 방해 펠 릿 없이 x에서 10 분 원심 분리기.</li>
		<li>다시 살 균 물의 500 µ L 각 펠 릿을 일시 중단합니다. 16,100 x g.에서 5 분 동안 원심 분리기</li>
		<li>Aspirate 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고입니다. Microfuge 관의 최종 무게 기록.</li>
		<li>최종 무게에서 microfuge 관의 초기 무게를 빼서 각 펠 릿의 무게를 결정.</li>
	</ol></li> <li>살 균 수를 사용 하 여 다시 일시 중단 10 mg/ml, C. albicans 펠 릿 및 200mg/mL에 OP50 펠 릿. 스의 50 mg/mL 해결책의 10 µ L, OP50 문화의 2.5 µ L, 0.5 µ L의 C. albicans 문화, 및 살 균 물 7 µ L를 결합 하 여 믹스 마스터 감염 확인.
	<ol><li>컨트롤 플레이트, 살 균 물 C. albicans 문화의 볼륨을 대체 하 여 마스터 믹스 만듭니다. 감염 믹스 또는 OP50는 micropipette를 사용 하 여 NGM 센터 플레이트에 제어 솔루션의 20 µ L 씨. 
		참고: 약 100 웜 분석 중 통계적 의미를 확인 하기 위해 필요 합니다. 이 분석 결과 3 중에서 일반적으로 실행 됩니다. 따라서, 감염 믹스 x 3.2 뿐만 아니라 제어 솔루션 x 3.2 이루어집니다. 이러한 믹스 약간 넘는 3 전체 20 µ L 오류를 위한 공간을 허용 하는 각 접시에 시드는 되도록 원래 배 되도록 만들어집니다. 이 마스터 믹스 벌레의 인 두 너무 작으면 초기 애벌레 단계 (L1-L3) C. albicans 소비 때문에 만들어집니다. 에 대 한 노출 fluconazole ( 그림 3B) 같은 약리 에이전트, 에이전트는 감염 혼합물에 소개 된다. 에이전트의 농도 경험적으로 결정 됩니다. 그러나 예를 들어 그림 3B, 50 µ M에서에서 0, 12.5, 25, 50, 100 µ M Fluconazole 했다 또한 Fluconazole 표시 됩니다 동일한 프로토콜을 사용 하 여 테스트.</li>
	</ol></li></ol> 8. 항문 영역 변형 (Dar) 표현 형 및 생존 분석 결과의 분석 <ol><li>시각화 Dar 형 참고: Dar L3 단계에서 그리고 저쪽에 최고의 시각 이다. 스 웜 ( 그림 2A), 시간이 지남에 따라 더 저명한 되는 게시물 항문 지역에 작은 돌출으로 선물 한다.
	<ol><li>확인 동물에 신속 하 게 해 부 현미경의 스테이지에 접시를 활용 하 여 다 르, 스 지 없이 동물 스와 동물 것 해야 하는 동안 즉시 뒤로 이동 하는 경우 반복 반대로 그들의 방향 또는 그들은 도청의 라운드 그렇게을 모두 할 것입니다.</li>
	</ol></li> <li>생존 분석 결과 <ol><li>완료 계란 준비 프로토콜 6 단계에서 앞에서 설명한 &#34; 계란 준비 &#34;. 계산 절 개 범위에서 계란 그리고 µ L 당 약 5-6 건강 한 계란의 농도 달성 될 때까지 M9 계란 솔루션을 희석. 세균성 문화 접시의 측면 사이 지역에서 준비 NGM 접시에 약 30 계란을 포함 하는 20 µ L 샘플 분배를 피 펫을 사용 하 여 (달걀과 벌레 음식, OP50, 두 가지 점이에 있다).</li>
		<li>품 20 ° c에서 48 h에 대 한 번호판입니다. 해 부 현미경 아래 스와 벌레의 수 뿐만 아니라 각 접시에 라이브와 죽은 성인 벌레의 수를 계산 합니다. 스와 % 기록.</li>
		<li>머리에는 알루미늄 와이어 또는 도청에 의해 도청 되 고 응답 하지 않으면 죽은 동물을 고려.</li>
		<li>다른 매일 전송 나머지 어른 벌레 따기 프로토콜 5 단계에 설명 된 대로 &#34; 청크와 따기 웜, &#34; 새로운 감염 또는 컨트롤 플레이트에. 이 시점에서 필요한 경우 수행 생존 분석 결과 매일 라이브, 죽은, 그리고 누락 된 벌레의 수를 추적 하 여. 
		참고:이 분석 결과 수 있습니다 실행 2 주 동안, 계란 준비 시작. 또한, 계란 솔루션 해야 하지 수 적절 세균성 문화에 솔루션은 OP50를 죽 일 수 있는 백제의 흔적을 포함 수 있습니다. 솔루션 또한 있어야를 적절 하 게는 플레이트의 가장자리에서 약 0.5 c m로 계란 접시와는 agar의 측면 사이 갇혀 될 수 있습니다. 또한, 벌레의 급속 한 확산으로 인해 새로운 접시에 성인 전송은 그들의 자손에서 그들을 분리 하는 중요 한.</li>
	</ol></li> <li>생존 분석 <ol><li>생존 곡선 분석 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 (재료의 목록 참조).</li>
		<li>비교 생존 곡선 Grehan Breslow Wilcoxon 메서드를 사용 하 여 (가정 하 초기 생존 시대에서 데이터는 최신 시간 보다 정확, 체중 데이터 따라) 뿐만 아니라 Logrank 통계 도구 45. 
		참고: 예를 들어 그림 4B에서 -C, C. albicans의 돌연변이로 치료 하는 벌레의 생존은 그에 비해 isogenic 야생-타입 컨트롤 또는 complementarystrains 치료.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리가 설명 하는 C. albicans 에 일생 노출 C. 선 충 감염 및 생존 시 금 하는 방법 다른 병원 체를 테스트를 수정할 수 있습니다. 다른 세균 이나 곰 팡이의 액체 문화 만든 하 고 비슷한 방식으로 C. 선 충 을 먹이 수 있습니다. 또한, 직렬 감염 분석 될 수 있습니다 설명, 한 병원 체에 애벌레를 먼저 노출 하 고 다음 성인 기에 도달 후 별도 병원 체를 포함 하는 새로운 접시에 동물?...

C. 선 충 50 년 이상에 대 한 강력한 모델 생물으로 사용 되었습니다. 1960 년대, 남아 프리 카 공화국 생물학자 시드니 브 레너 선 충에서 세포 및 동물 생물학의 다양 한 측면을 연구 과학자의 긴 계보에 대 한 방법을 포장 신경 개발 공부 C. 선 충 의 사용을 개척. 크레이그 멜로 앤드류 불 그들의 RNAi 작업1에 대 한, 로버트 Horvitz 및 기관 발달에 apoptosis2,3,4, 그들의 작품에 대 한 존 Sulston 마틴 챌 노벨상 수 상자를 포함 하는이 계보 녹색 형광 단백질5에 그의 작품은. 이 모델 생물 전통적으로 지난 15 년 동안 분자 및 발달 생물학을 공부 하는 데 사용 되었습니다, 비록 연구원 C. 선 충 녹을 포함 하 여 다양 한 인간의 병원 균의 생물학 조사를 사용 하 여 시작 녹 농 균, 황색 포도상구균, 살 모 넬 라 enterica, Serratia marcescens6,7,8,,910. 이 연구 결과 밝혀 많은 인간 병원 체 상호 작용에 관련 된 메커니즘의 보존은 또한 선 충, 하지만에서이 모델 생물11,12에 고유한 일부 면역 메커니즘이 있습니다. 자연 속에서 C. 선 충 에서 다양 한 위협 으로부터 섭취 한 병원 체는 토양에 존재 하 고이 진화 하 고 그것의 창 자 루멘에 세련 된 타고 난 면역 체계를 유지 하는 강한 선택적인 압력을 제공 했다. 유전자 및 창 자 루멘의 보호에 관련 된 메커니즘의 대부분은 또한 높은 포유류11,13에 존재 하는 높은 보존 요소에 의해 조율 된. C. 선 충 은 따라서 살 모 넬 라 enterica14, Shigella boydii15또는16 비 브리 오 콜레라같이 위장 병원 체를 공부 하기 좋은 모델을 나타냅니다.
여기 우리는 C. albicans같은 전염 성 요원 연구 모델 호스트로 C. 선 충 의 놀라운 다양성을 강조 표시 합니다. C. 선 충 모델 호스트 저렴 하 고 일반적으로 칸디 다42를 공부 하는 데 사용 되는 마우스 모델 보다 시간이 소요 되는 독성에 대 한 높은 처리량 검열 수 있습니다.
이 연구에서 우리는이 모델 및 assosiated 생존 분석 결과 사용할 수 있는 안정적으로 호스트 타고 난 면역 이펙터 중화 감염, 독성, 드라이브 병원 체 결정 하는 중요 한 공부에 대 한 표시 및 약리 화합물 수 있는 병 인에 개입. 앞에서 설명한 분석 실험에 비슷하지,이 방법은 죽음43,44만 성인 보다는 성인, 애벌레 단계에서 동물의 일생 동안 공부 하는 병원 체에 노출의 수단을 제공 합니다. 요약 하면, 우리의 C. 선 충 - C. albicans 모델 뿐만 아니라 감염 및 면역 유전 기초 연구 뿐만 아니라 치료 적 개입에 대 한 새로운 화합물을 식별 사용할 수 있는 다양 하 고 강력한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

모델 호스트 꼬마 선 충 을 사용 하 여 미생물의 상호 작용을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 미생물은 소장 질환에 대 한 기본 위치를 만드는 다이어트를 통해 소개 합니다. 선 충 장 구조상으로 그리고 기능적으로 포유류 창 모방 이며 투명 한 식민의 현미경 연구 의무가 만들기. 여기 우리가 병원 체 질병과 죽음을 발생할 수 있습니다 보여줍니다. 변경 된 독성을 나타내는 미생물 돌연변이 식별할 수 있습니다. 생물 스트레스를 보존된 타고 난 응답은 C. 선 충 호스트 타고 난 면역 상호 작용의 측면을 우수한 시스템. 우리는 듀얼 산화 효소 유전자에 있는 돌연변이와 호스트 반응성 산소 종 생성 수 없습니다 및 미생물 모욕을 저항할 수 없습니다 보여줍니다. 추가 제시 생존 분석 결과의 다양성 미생물 성장 억제제의 효과 연구에 사용할 수 있습니다 표시 하 여 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 새로운 항진균 제의 개발에 대 한 대상으로 곰 팡이 독성 요소를 발견 하 고 더 호스트-미생물 상호작용을 폭로 하는 기회를 제공 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과의 디자인 잘에 빌려준다 높은 처리량 전체 게놈 스크린을, 나중에 사용할 곳을 알아내는-보존 웜 수 하면 공부 비용 효과적이 고 매력적인 전체 동물 모델.

병 인 분석 결과 (그림 1) C. albicans 및 C. 선 충 을 사용 하 여 이전 우리의 실험실17,18 및20다른 연구소19,의해 설명 하고있다. C. 선 충 C. albicans 셀 벌레에 의해 신속 하 게 섭취 하 고 느린 운동을 일으키는 창 자 루멘에 축적을 보여주는 <...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K 조회수.  Worcester Polytechnic Institute. 여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

연구

유전학

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

면역학 및 감염병학

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

생물학

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their gut microbiomes. While experiments with well-characterized bacteria or defined bacterial communities can facilitate the analysis of molecular mechanisms, studying nematodes in their natural microbial context is essential for exploring the diversity of such mechanisms. At the same time, the isolation of worms from the wild is not always feasible, and, even when possible, sampling from the wild restricts the use of the genetic toolkit otherwise available for C. elegans research. The following protocol describes a method for microbiome studies utilizing compost microcosms for the in-lab&#160;growth in microbially diverse and natural-like environments.
Locally sourced soil can be enriched with produce to diversify the microbial communities in which worms are raised and from which they are harvested, washed, and surface-sterilized for subsequent analyses. Representative experiments demonstrate the ability to modulate the microbial community in a common soil by enriching it with different produce and further demonstrate that worms raised in these distinct environments assemble similar gut microbiomes distinct from their respective environments, supporting the notion of a species-specific core gut microbiome. Overall, compost microcosms provide natural-like in-lab environments for microbiome research as an alternative to synthetic microbial communities or to the isolation of wild nematodes.

Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans

Compost microcosms bring the microbial diversity found in nature into the laboratory to facilitate microbiome research in Caenorhabditis elegans. Provided here are protocols for setting up microcosm experiments, with the experiments demonstrating the ability to modulate environmental microbial diversity to explore the relationships between environmental microbial diversity and worm gut microbiome composition.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

The nematode Caenorhabditis elegans is emerging as a useful model for studying the molecular mechanisms underlying interactions between hosts and their ...

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

요약

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

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RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화