Este trabajo fue realizado en y apoyado por el Instituto Politécnico de Worcester.

1. preparación de medio de crecimiento nematodo (NGM) <ol><li>para 1 L de medios de comunicación combinan agar 20 g, 2,5 g fuente de nitrógeno orgánico (e.g., bacto-peptona) y 3 g de cloruro de sodio en un matraz de 2 L. Añadir 975 mL de agua estéril.
	<ol><li>Agregar en una barra de agitación estéril. Si se utiliza un dispensador automático de medios de comunicación, tubería de autoclave y media durante 15 min; los medios de comunicación deben ser esterilizado para ya si es un volumen más alto.</li>
	</ol></li> <li>Establecer los medios de comunicación en remover la placa y deje para enfriar.
	<ol><li>Una vez que los medios de comunicación está caliente al tacto (aproximadamente 60 ° C) asépticamente añada 1 mL de 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL de 1 M de CaCl 2, 25 mL de KPO 4 y 1 mL de colesterol de 0,5% en etanol.</li>
		<li>Vierta media (manualmente o por bomba automática) bajo flujo laminar en 35 x 10 mm placas de petri estériles. Deje que se seque bajo campana por 1-2 días antes de su uso. 
		Nota: Las placas deben guardarse a 4 ° C para evitar la contaminación.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hacer un gusano Pick <ol><li>corte un pedazo de 1,5 cm de alambre de aluminio. Cuidadosamente Inserte la punta de una pipeta Pasteur aproximadamente 0,5 cm de esta longitud.
	<ol><li>Usando un quemador de Bunsen o lámpara de alcohol, fundir la punta de la pipeta de cristal girando lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiere firmemente a la pipeta, sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparación de la cultura de e. coli <ol><li>utilizando un asa estéril, inocular una colonia de e. coli cepa OP50 en 200 mL de caldo Luria. Incubar durante una noche con agitación a 37 ° C.</li>
	<li>El cultivo líquido está listo para usar al día siguiente y pueden ser almacenada a 4 ° C cuando no esté en uso. 
	Nota: La cepa de e. coli, OP50, se utiliza como fuente de alimento para C. elegans. Este cultivo puede ser utilizado por hasta varios meses si se almacena a 4 ° C.</li>
</ol> 4. Esencial C. elegans mantenimiento <ol><li>semilla preparada las placas de agar NGM con e. coli por manchas aproximadamente 50-100 μl de preparados OP50 cultivo líquido en el centro de la placa de.</li>
	<li>Placas y déjelos secar a temperatura ambiente durante 24 h. Una vez seco, colocar las placas a 37 ° C durante la noche para un rápido crecimiento o mantener a temperatura ambiente, si se desea un crecimiento más lento.</li>
	<li>Añada gusanos a la placa o &#34; trozos, &#34; (ver protocolo paso 5 &#34; Chunking y recogiendo gusanos &#34;), recogiendo gusanos individualmente o colocar huevos de gusano directamente sobre la placa (ver protocolo paso 6 &#34; huevo preparación &#34;).</li>
</ol> 5. Chunking y recogiendo gusanos Nota: &#34; trozos, &#34; se refiere a una práctica que es común en el mantenimiento de C. elegans. Se trata de cortar una sección de la placa de agar NGM que contiene gusanos y así también transferir esta pieza en un plato nuevo, transferir un gran número de gusanos en el proceso. La contaminación también puede cortar de la placa de esta manera. Cuando recogiendo gusanos, es importante mantener la integridad del agar porque gusanos pueden ser perdidos en los agujeros en el agar. Además, es importante permitir que la hoja se enfríe antes de tocar la placa para evitar fundir el agar o quema los gusanos.
<ol><li>Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos en las nuevas placas, cortar un trozo de agar NGM que contiene las lombrices seleccionadas con una espátula. Retirar la pieza cortada y poner cara abajo en el borde del césped de OP50 en un plato nuevo.</li>
	<li>Transferencia de gusanos individualmente como se describe a continuación en el paso de protocolo 8.2, &#34; Análisis de la supervivencia, &#34; utilizando un gusano pick. La llama el alambre en la recogida del gusano hasta que esté rojo. Retire del fuego y deje que se enfríe durante unos segundos.</li>
	<li>Con el cable en la selección, raspar suavemente el césped de la cultura OP50 crecido en la placa de nuevo, cubriendo el hilo en el pico.</li>
	<li>La cultura viscosa que cubre la punta del alambre hace gusanos se pegan a la punta de la ganzúa, así suavemente recoger gusanos seleccionados con un movimiento de swiping.</li>
	<li>Una vez que las lombrices se reúnen, colocarlos en un plato nuevo deslizando suavemente la cultura en el agar. Coloque el alambre en la llama para eliminar la cultura restantes en la selección.</li>
</ol> 6. Preparación del huevo <ol><li>colocar aproximadamente 20 animales adultos (aproximadamente 2-3 días después de la eclosión, cuando se cultiva a 20 ° C) por cosecha o por trozos como se describe en el paso 5, de protocolo &#34; Chunking y recogiendo gusanos, &#34; en una placa sembrada con 50 Μl de cepa de e. coli, OP50.</li>
	<li>a recoger los huevos, inundar la placa con 10 mL de buffer M9 después de 1-2 días. Utilizando una pipeta serológica de vidrio, agitar y agitar suavemente el contenido sobre la placa de agar para lanzar huevos atascados OP50 o animales adultos. Recoger todo el líquido que contiene los huevos y adultos.</li>
	Tubo de <li>solución de transferencia M9 y OP50 en un cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo cónico de 15 mL a 2.100 x g durante 2 min</li>
	<li>Aspirar aproximadamente 9 mL del sobrenadante sin perturbar el pellet OP50.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 2 mL de agua estéril, 1 mL de blanqueador y 1 mL de NaOH M 0.25.</li>
	<li>Mezclar suavemente por inversión hasta que la mayoría (aproximadamente el 70 por ciento) de los animales adultos aparece sometidas a lisis, por lo general, huevos permanecen intactos durante este tratamiento blanqueador corto debido a su cáscara. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante 2 min</li>
	<li>Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspenda el sedimento en 10 mL de buffer M9.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico en 990 x g para 2 min aspirar sobrenadante sin pellets inquietante. Vuelva a suspender los pellets con 200 μL de buffer M9. 
	Nota: La preparación de huevo puede requerir múltiples ensayos. Huevos pueden ser destruidos si se exponen para blanquear demasiado. Si no salen de los huevos, disminuir la concentración de cloro en solución o disminuir la duración de la exposición a bleach.</li>
</ol> 7. Instalación de placa de infección <ol><li>distribuir 3-5 mL de YPD en un tubo de ensayo estéril y sembrar con una sola Colonia de Candida albicans utilizando un asa estéril.
	<ol><li>Coloque el tubo en un tambor rotatorio para aproximadamente 16-18 h a 30 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Etiqueta un 1,5 mL tubo de microcentrífuga para contener C. albicans y otro para contener OP50. Registrar el peso de cada tubo de vacío.
	<ol><li>Lugar 500 μl de la noche a la mañana cultura de C. albicans en el tubo con la etiqueta C. albicans y 1.500 μl de la noche a la mañana OP50 cultura (paso 3.1) en el tubo etiquetado OP50.</li>
		<li>Centrifugar 10 min a 16.100 x sobrenadante de aspirado g. sin pellets inquietante.</li>
		<li>Resuspender cada pellet con 500 μl de agua estéril. Centrifugar durante 5 min a 16.100 x g.</li>
		<li>Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Registrar el peso final de los tubos del microfuge.</li>
		<li>Determinar el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microcentrífuga del peso final.</li>
	</ol></li> <li>Con agua estéril, Resuspender el pellet de C. albicans a 10 mg/mL y el sedimento OP50 a 200 mg/mL. Hacer una infección principal mezcla combinando 10 μl de una solución de 50 mg/mL de estreptomicina, 2.5 μl de cultivo OP50, 0,5 μl del cultivo de C. albicans y 7 μl de agua estéril.
	<ol><li>Para las placas de control, crear una mezcla principal reemplazando el volumen de la cultura de C. albicans con agua estéril. De semilla de 20 μl de mezcla de infección o solución de control OP50 sobre las placas del centro de NGM utilizando una micropipeta. 
		Nota: Se necesitan aproximadamente 100 gusanos para determinar significación estadística durante el análisis. Este ensayo se ejecuta normalmente por triplicado. Por lo tanto, se hace un 3.2 x mezcla de infección, así como a 3.2 x solución de control. Estas mezclas se hacen para ser un poco sobre 3 x el original para asegurarse de que se siembra un total de 20 μl en cada plato, permitiendo espacio para error. Esta mezcla principal se crea porque la faringe del gusano es insuficiente durante las primeras etapas larvales (L1-L3) consumir C. albicans. La exposición a agentes farmacológicos como el fluconazol ( figura 3B), el agente se introduce en la mezcla de la infección. Empíricamente se determina la concentración del agente. Por ejemplo, en la figura 3B, 50 μm fluconazol está representado, sin embargo 0, 12,5, 25, 50 y 100 μm fluconazol también fueron probados usando el mismo protocolo de.</li>
	</ol></li></ol> 8. Análisis del fenotipo de deforma la región Anal (Dar) y análisis de supervivencia <ol><li>Visualize el fenotipo de Dar Nota: Dar mejor se visualiza en la fase L3 y más allá. Dar se presenta como una pequeña protuberancia en la región anal post del gusano ( figura 2A), que llega a ser más prominente con el tiempo.
	<ol><li>Confirmar si un animal tiene Dar rápidamente tocando la placa en la etapa del microscopio de disección, animales sin Dar voluntad mover hacia atrás inmediatamente, mientras que animales con Dar cualquier necesidad repetidas rondas de tapping para invertir su dirección, o no lo hará en todo.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de supervivencia <ol><li>preparación de huevo completo, como se describió anteriormente en el paso del Protocolo 6, &#34; huevo preparación &#34;. Contar los huevos bajo el alcance de la disección y diluir la solución de huevo con M9 hasta alcanza una concentración de aproximadamente 5-6 huevos sanos por μl. Utilizando una pipeta, dispensar 20 μl de muestra que contenga aproximadamente 30 huevos en plato NGM preparado, en el área entre el cultivo bacteriano y el lado de la placa (huevos y comida de gusano, OP50, están en dos lugares distintos).</li>
		<li>Incubar las placas a 20 ° C durante 48 h. Debajo de un microscopio de disección, cuenta el número de gusanos vivos y muertos adultos en cada plato, así como el número de gusanos con Dar. Registrar el porcentaje con Dar.</li>
		<li>Considerar un animal muerto si no responde al ser golpeada en la cabeza por un alambre de aluminio o golpear ligeramente en la plancha.</li>
		<li>Día, transferencia gusanos adultos restantes por selección como se describe en el paso 5, de protocolo &#34; Chunking y recogiendo gusanos, &#34; en un plato nuevo de infección o control. En este punto, si es necesario, realizar un análisis de supervivencia mediante el seguimiento del número de gusanos vivos, muertos y desaparecidos cada día. 
		Nota: Este ensayo puede funcionar durante dos semanas, comenzando con la preparación de huevo. Además, la solución de huevo debe no distribuirá en el cultivo bacteriano, como la solución puede contener trazas de cloro que puede matar el OP50. La solución también debe ser despachado aproximadamente 0,5 cm del borde de la placa, como huevos pueden atorarse entre los lados de la placa y el agar. Además, debido a la rápida proliferación de gusanos adultos en nuevas placas de transferencia es fundamental para separarlos de su progenie.</li>
	</ol></li> <li>Analizar la supervivencia <ol><li>analizar los resultados utilizando el software de análisis de curva de supervivencia (véase lista de materiales).</li>
		Curvas de <li>compara la supervivencia mediante el método de Breslow-Grehan-Wilcoxon (suponiendo que los datos de los primeros tiempos de supervivencia son más precisos que tiempos posteriores, los datos de peso por consiguiente) así como herramientas estadísticas de rango logarítmico 45. 
		Nota: Por ejemplo, en la Figura 4B -C, la supervivencia de gusanos tratados con mutantes de C. albicans es comparada con aquellos tratados con controles de tipo salvaje isogénicas o complementarystrains.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de ensayo de infección de C. elegans y supervivencia sobre exposición de por vida a C. albicans que hemos descrito pueden ser modificados para probar otro patógeno. Cultivos líquidos de otra bacteria u hongo pueden hechos y alimenta a C. elegans de manera similar. Además, pueden ensayarse la serie infecciones exponer primero la larva a un patógeno como se describe, y luego transferir los animales en un nuevo plato que contiene un patógeno independiente después de alcanzar l...

C. elegans se ha utilizado como organismo modelo de gran alcance para más de 50 años. En la década de 1960, biólogo sudafricano Sydney Brenner pionero en el uso de C. elegans a estudiar desarrollo neuronal, allanando el camino para un largo linaje de científicos para estudiar diversos aspectos de la biología celular y animal de nematodos. Este linaje incluye a galardonados con el Premio Nobel Craig Mello y Andrew Fire para su trabajo de ARNi1, Robert Horvitz y John Sulston por su trabajo en el desarrollo de órganos y apoptosis2,3,4, Martin Chalfie por sus trabajos sobre la proteína fluorescente verde5. Aunque este organismo modelo se ha utilizado tradicionalmente para el estudio de biología molecular y del desarrollo, en los últimos 15 años, los investigadores han comenzado a utilizar C. elegans para investigar la biología de los patógenos humanos diversos incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericay Serratia marcescens6,7,8,9,10. Estos estudios revelaron que muchos de los mecanismos implicados en la interacción de patógenos humanos se conservan en nemátodos, pero también que hay algunos mecanismos de inmunidad que son exclusivos de este organismo modelo11,12. En la naturaleza, C. elegans se encuentra con una variedad de amenazas de los agentes patógenos presentes en el suelo y esto ha proporcionado una fuerte presión selectiva para evolucionar y mantener un sistema inmune innato sofisticado en su lumen intestinal. Muchos de los genes y mecanismos involucrados en la protección de la luz intestinal están orquestados por elementos altamente conservadas que también existen en los mamíferos superiores11,13. C. elegans , por tanto, representa un gran modelo para el estudio de patógenos gastrointestinales como Salmonella enterica14, Shigella boydii15o16de cólera del vibrión.
Aquí destacamos la notable versatilidad de C. elegans como anfitrión modelo para el estudio de agentes infecciosos tales como C. albicans. C. elegans como anfitrión modelo permite la detección de alto rendimiento de virulencia que es menos costoso y desperdiciador de tiempo que un modelo de ratón, que se utiliza comúnmente para el estudio de la candidiasis42.
En este estudio, mostramos que este modelo y el análisis de supervivencia assosiated pueden ser confiablemente utilizados para estudiar efectores inmune innata del huésped importantes para contrarrestar infecciones, determinantes patógenos que virulencia, y compuestos farmacológicos que pueden intervienen en la patogénesis. Diferentes ensayos anteriormente descritos, este método proporciona un medio de estudiar la exposición a un patógeno durante la vida del animal, desde el estado larvario a la edad adulta, en lugar de sólo la edad adulta a muerte43,44. En Resumen, nuestro C. elegans - modelo de C. albicans es una herramienta versátil y poderosa que puede utilizarse no sólo para estudiar las bases genéticas que conducen a la infección y la inmunidad, sino para identificar nuevos compuestos para la intervención terapéutica.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulated, bacterilogical grade)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Inverted Microscope</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller&#039;s)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dishes (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Wildtype C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

the nematode caenorhabditis elegans - a versatile in vivo model to study host-microbe interactions

Demostrar un método usando Caenorhabditis elegans como anfitrión modelo para estudiar la interacción microbiana. Microbios se introducen a través de la dieta haciendo que el intestino la ubicación primaria de la enfermedad. El intestino nemátodo estructural y funcionalmente imita los intestinos mamíferos y es transparente lo que es susceptible de estudio microscópico de la colonización. Aquí mostramos que el patógeno pueden causar enfermedad y muerte. Somos capaces de identificar a mutantes microbianos que muestran alteración de la virulencia. Su respuesta innata conservado a estreses bióticos hace C. elegans un excelente sistema para sondear facetas de interacción inmune innata de host. Mostramos que hosts con mutaciones en el gen de la oxidasa dual no pueden producir especies reactivas de oxígeno y son incapaces de resistir el insulto microbiano. Además demostramos la versatilidad del ensayo de supervivencia presentado mostrando que puede ser utilizado para estudiar los efectos de los inhibidores del crecimiento microbiano. Este ensayo también puede ser usado para descubrir factores de virulencia de hongos como dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos, así como proporcionar una oportunidad para descubrir otras interacciones host-microbio. El diseño de este ensayo presta bien a alto rendimiento pantallas de todo el genoma, mientras que la capacidad de gusanos de crio-conservar para uso futuro, es un modelo rentable y atractivo todo animal para el estudio.

Un análisis de la patogenia (figura 1) con C. albicans y C. elegans se ha descrito previamente por nuestro laboratorio17,18 y otros laboratorios19,20. Demostramos la receptividad del uso de C. elegans para el estudio de virulencia de C. albicans que demuestran que las células de C. albicans son in...

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

9.3K vistas.  Worcester Polytechnic Institute. Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

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Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

<meta charset="utf8"></head><body>Dos ensayos de infección para estudiar fenotipos de virulencia no letales en C. albicans utilizando C. elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

Dos ensayos de infección para estudiar fenotipos de virulencia no letales en C. albicans utilizando C. elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

Investigación

Genética

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Inmunología e Infección

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human diseases have been reported to be associated with four species of bacteria: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, and Aeromonas caviae. The model organism Caenorhabditis elegans is a bacterivore that provides an excellent infection model by which to study the bacterial pathogenesis of Aeromonas. Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection using a C. elegans model, including survival, liquid toxicity, and muscle necrosis assays. The results of the three methods determining the virulence of Aeromonas were consistent. A. dhakensis was shown to be the most toxic among the 4 major Aeromonas species causing clinical infections. These methods are shown to be a convenient way to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species and contribute to our understanding of the pathogenesis of Aeromonas infection.

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Here, we introduce three different experiments to study Aeromonas infection in C. elegans. Using these convenient methods, it is easy to evaluate the toxicity among and within Aeromonas species.

Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Biología

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Resumen

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Capítulos en este video

Dos ensayos de infección para estudiar fenotipos de virulencia no letales en C. albicans utilizando C. elegans

Dos ensayos de infección para estudiar fenotipos de virulencia no letales en C. albicans utilizando C. elegans

La separación automatizada de

Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans