Monoklonale Antikörper werden als monospezifische Antikörper bezeichnet, die aus einem einzigen B-Lymphozytenklon und den monovalenten Antikörpern hergestellt werden, die an dasselbe Epiton binden. In jüngster Zeit hat sich der monoklonale Antikörper-basierte ELISA zu unserer neuen Plattform für die qualitative oder quantitative Analyse von Lebensmitteln oder Naturprodukten entwickelt. Diese Methode ist eine genaue, empfindliche und effektive Methode ohne mühsame Vorbehandlungsschritte.
Das ist also das Wesentliche für biologische Proben und die zukünftigen klinischen Anwendungen. Die Vorbereitung der mABs von TCM ist ein wichtiger Schritt in Studien über komplexe Systemeigenschaften der TCM-Formel. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um mABs gegen die kleinen molekularen Verbindungen zu erzeugen, einschließlich künstlicher Antigensynthese, Mausimmunisierung und Zellfusion.
Das Hapten ist mit dem Trägerprotein verbunden, um das künstliche Antigen zu synthetisieren. Künstliches Antigen und vollständige Hilfsstoffe werden gemischt und emulgiert. Die Maus wurde durch subkutane Injektion immunisiert.
Nehmen Sie die Milz der immunisierten Maus heraus und machen Sie einzellige Suspension. Mischen Sie die Myelomzellen. Splenozyten werden isoliert und mit HAT-empfindlichen Mausmyelom-Zelllinien nach PEG-Methode verschmolzen.
Wählen Sie eine Zelllinie aus, die Antikörper per ELISA vorbereiten kann. Hybridome, die monoklonale Antikörper absondern, die gegen Antigen reaktiv sind, werden geklont. Stellen Sie fest, dass die Hybridom-Zelllinie kryokonserviert ist.
Periodatoxidationsverfahren wurde für die Synthese eines Narigin-BSA-Konjugats verwendet. Zunächst wurde Narigin in einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei 100 Mikroliter frisch zubereiteter Natriumpariodate-Lösung auf fünf Milliliter der Nariginlösung aufgelöst. Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Zweitens, fügen Sie zwei Milliliter Trägerprotein in das Narigin Natriumperiodat-Reaktionsgemisch. Passen Sie die Mischung auf pH-Neun-Lösung an und reagieren Sie sechs bis acht Stunden lang. Drittens wurde das künstliche Antigen mit Dialysemethode in PDS für drei Tage gereinigt, um den CBS zu entfremden.
Freunds vollständiges adjuvantes und unvollständiges Adjuvans wurden zur Mausimpfung verwendet. Für die Impfung 50 Mikrogramm Konjugat mit einem gleichen Volumen von Freunds komplettem Adjuvans mischen und vollständig emulgieren. Verwalten Sie 100 Mikrogramm dieser Mischung zu jeder BALB/c Maus über eine dorsale subkutane Injektion.
Liefern Sie eine Booster-Impfung durch subkutane Injektion zwei Wochen später mit der gleichen Menge an Konjugat mit unvollständigem Adjuvans gemischt. Zur primären Immunisierung wurden Freunds komplettes Adjuvans und Immunogen mittels subdermaler Injektion eingesetzt. Zur Booster-Impfung wurden Freunds unvollständiges Adjuvans und das Immunogen mittels subdermaler Injektion eingesetzt.
Zur Wirkungsimpfung ohne Adjuvans wurden nur Immungen mittels subdermaler Injektion oder intraperinealer Injektion verwendet. Futterschichtzellen stammen hauptsächlich aus abdominalen Epithelzellen oder Makrophagen. RPMI 1640 FBS und HAT wurden zur Vorbereitung von HAT-Bildschirmmedium verwendet.
HAT Ergänzung wurde in 10 Milliliter RPMI Medium aufgelöst, dann in 500 Milliliter RPMI 1640 mit 20%FBS hinzugefügt. Und die ICR-Maus wurde fünf Minuten lang mit 75% Ethylalkohol sterilisiert. Nach dem Entfernen des Fells aus dem Bauch mit hämostatischen Zangen, desinfizieren Sie den Bereich mit 75%Ethanol.
Schneiden Sie die äußere Haut, um die Bauchhöhle freizulegen. Injizieren Sie drei Milliliter steriles RPMI 1640 Medium in den Bauch. Dann massieren Sie den Bauch, um zusätzliche Zellen in die Lösung zu lösen.
Aspirieren Sie die fetale Zellsuspension in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Nach zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 10 Minuten bei 1.000g, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die fetalen Zellen, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Nach diesem Verfahren lösen Sie die Zellen mit HAT-Medium auf.
Zählen Sie die Zellen, um sie 100.000 Pro Milliliter aus Zellmitgliedern zu machen. Übertragen Sie die Zellen in 96 Brunnenzellkulturplatten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad, 5% Kohlendioxid.
Die gewählte immunisierte Maus wurde fünf Minuten lang mit 75% Ethylalkohol sterilisiert. Aspirieren RPMI 1640 medium als Waschpuffer. Entfernen Sie die Haut und das Muskelgewebe mit einer Schere, um die Milz freizulegen.
Isolieren Sie die Milz durch die Pinzette sorgfältig. Dann waschen Sie die Milz im RPMI 1640. Die Milz isolieren und in Stücke schneiden.
Langsam hämmern die Milz. Dann wurde es mit einem RMPI 1640 Medium behandelt, um die Zellen aufzulösen, um eine Milzzellsuspension vorzubereiten. Danach wurden die Zellen mit 800 Netzzellensieb gefiltert.
Nageln Sie die Milz sorgfältig, um die großen Gewebe zu entfernen. Die Vermeidung großer Gewebe beeinflusst die Zellfusion. War die Milzzellensuspension mit RPMI 1640 medium.
Anschließend wurde die Zellsuspension in das Zentrifugenrohr eingebracht. Ernten Sie die Milzzellen durch Zentrifugation bei 1 000g für 10 Minuten. Und dann den Überstand entsorgen.
Die Milzzellen sollten eine Milliarde bis 10 Milliarden betragen. Entfernen Sie die kultivierten und verstärkten Myelomzellen aus dem Inkubator und schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um eine Zellsuspension zu erhalten. War die Federung mit RPMI zweimal.
Mischen Sie die Milzzellsuspension und die Myelomzellen. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Konzentration an. Die endgültige Ration der Milzzellen zu Myelomzellen sollte ein bis fünf bis eins bis zehn sein.
Zentrifugieren Sie die Zellmischung und entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie den Zellen einen Milliliter 50% Polyethylenglykollösung hinzu und rühren Sie sie vorsichtig bei 37 Grad für eine Minute. Stehen für 30 Sekunden, fügen Sie zwei Milliliter RPMI 1640 Medium und inkubieren bei 37 Grad für zwei Minuten, um die Reaktion zu beenden.
Fügen Sie in zwei Milliliter RPMI für eine weitere Minute. Fügen Sie dann in 10 Milliliter RPMI 1640. Zentrifuge bei 800g für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie HAT-Lösung hinzu und kultivieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad 5%Kohlendioxid. Nach sieben Tagen wurden Zellüberstandstoffe in 96 Brunnenplatten nach der Zellfusion angesaugt und in ELISA-Platten vorbeschichtet mit Beschichtungsantigen gegeben. Eine Stunde lang bei 37 Grad kultiviert, wurde ein sekundärer Antikörper zugesetzt und eine halbe Stunde lang kultiviert.
Nach 100 Mikroliter Substratlösung hinzufügen. Stoppen Sie die Reaktion. Um die ELISA-Platten in den Mikroplattenleser zu bringen, wurde die Endpunktmethode verwendet, um die Daten mit 450 Nanometern zu lesen.
Gemessene Absorption bei 450 Nanometer und Schirmen der positiven Hybridome. Verwenden Sie die Begrenzende Verdünnungsmethode, um die monoklonalen Hybridome vorzubereiten. Nachdem Sie das Huntington-Medium aus den ausgewählten Hybridomen entfernt haben, setzen Sie die Zellen in RPMI 1640 erneut aus und zählen Sie sie.
Verdünnen Sie die Zellen einer Konzentration von einer Zelle, zwei Zellen und vier Zellen pro Brunnen mit RPMI 1640 in einer 96-Well-Platte und -Kultur. Übertragen Sie Zellen aus den Hybridomen, die positiv sind, auf 24 Brunnenplatten, 25 und 75 Quadratzentimeter Kolben für den Anbau. Bewahren Sie die Myodomas 24 Stunden lang in einer Gradientenkühlbox bei minus 80 Grad auf.
Dann in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung übertragen. Titer von Antiseren wurden durch indirekte ELISA bestimmt. Maus eins bis vier wurde mit Narigin BSA-Konjugat immunisiert war deutlich höher als die Steuermaus ohne geimpft.
Der Titer von eins bis 5 000 ist ausreichend Diffusion. Das Molekulargewicht des Haptenkonjugats wurde durch die MALDI-TOF-Analyse bestätigt. Wie in Abbildung 2 dargestellt, können wir als Molekulargewicht von BSA-Standard und Narigin berechnen und bestimmen, dass die Moleküle von Narigin mit BSA konjugiert wurden.
Nur das Hybridom kann in HAT-Auswahlmedien überleben und wachsen. Nach sieben Tagen Wachstum kann die Zellkultur per ELISA getestet werden. Die positiven Hybridome wurden neu geklont und erweitert.
Diese Bilder zeigen das herkömmliche Ergebnis für stabile monoklonale und polyklonale Hybridom-Zelllinien. Der kritische Punkt dieses Experiments ist das Screening der mAbs spezifisch für das Hapten-, aber nicht trägerprotein. Die Spezifität des mAb wurde dann in Gegenwart anderer strukturell verwandter Verbindungen untersucht.
Die Kreuzreaktivität wurde berechnet, um die mAb-Spezifität des Antigens zu bewerten. Die Kalibrierkurve von Naringin und der Liner-Bereich wurden ermittelt. Die antigenspezifischen monoklonalen Hybridome wurden erweitert und in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung kryokonserviert.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, hoffe ich, dass Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man monoklonale Antikörper gegen kleine molekulare Verbindungen erzeugt. Das ist also alles. Vielen Dank für Ihre Beobachtung und viel Glück für Ihre Experimente.
