يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الوراثة اللاجينية مثل آليات تنظيم الجينات وعلاقات السبب والنتيجة بين العناصر التنظيمية المختلفة للكروماتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه للمرة الأولى من الممكن أن وحدة loci الكروماتين مع الإنزيمات الذاتية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. عموما سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال لأن ثقافة ESL الماوس من الصعب بطبيعتها بالنسبة لأولئك الذين لم يتم تدريبهم على هذه التقنية.
مزيد من التوضيح من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما خطوات العدوى الفيروسية الخلية من الصعب تعلم. يجب على الباحث أن يُلزمنا خطين منفصلين لثقافة الخلية ومن الضروري مراقبة السلامة بيقظة خلال هذه الخطوات. للبدء في البروتوكول، مرور 18 مليون من خلايا HEK 293T لكل لوحة 50 سنتيمترا.
التعرق وسائل الإعلام القديمة وإضافة 10 ملليلتر من واحد الفوسفات X المخزنة المالحة، أو برنامج تلفزيوني. استلهم برنامج تلفزيوني وإضافة ثلاثة ملليلترات من 0.05٪التربسين. احتضان الخلايا في التربسين لمدة ثماني دقائق في 37 درجة مئوية.
صخرة والاستفادة من الخلايا في منتصف الطريق من خلال الحضانة. في اليوم التالي, عندما وصلت الخلايا 60 إلى 80٪ التقاء, أداء البولي إيثيلينمينمين, أو PEI, transfection. بعد ذلك، اخلط بلطف الحمض النووي، PEI، ووسائط النقل في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة، إضافة الحل قطرة إلى لوحة 15 سم. ثم، احتضان العينة لمدة 16 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي، تُطرّح وسائل الإعلام واستبدلها بلطف بـ 293 وسائط هكية جديدة إلى 15 سم. بعد تبادل وسائل الإعلام، احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت.
تم إعداد mESC مسبقًا في شكل 12 طبقًا جيدًا مع 100,000 خلية في بئر واحد قبل يوم واحد من الإصابة. للخلايا التي تزرع في شكل 10 سم، التعرق وسائل الإعلام القديمة، إضافة خمسة ملليلترات من واحد X PBS، وpirpirate برنامج تلفزيوني، وإضافة ملليلتر واحد من 0.25٪التربسين. احتضان الخلايا في التربسين لمدة ثماني دقائق في 37 درجة مئوية والصخور والاستفادة من الخلايا في منتصف الطريق من خلال الحضانة.
بعد 48 ساعة من تبادل وسائل الإعلام، وإزالة ونقل ناظر من خلايا 293T HEK إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه حطام الخلية. بعد ذلك، قم بتصفية الماظر من خلال غشاء 0.45 ميكرون.
تركيز الفيروس عبر فائقة الطرد مع دوار SW32 وتدور العينة في 72، 000 مرات G لمدة ساعتين ونصف الساعة في أربع درجات مئوية. في حين أن الفيروس يركز تحت الطرد فائق التركيز ، وعلاج mESC وكالة المخابرات المركزية في لوحة 12 جيدا مع الجذعية الجنينية الطازجة أو وسائل الإعلام ES تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من البوليبرين. عندما تم الانتهاء من تركيز الفيروس، وpirpirate بعناية عظمى وتعليق بعناية بيليه الفيروس في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني X واحد لتجنب فقاعات الزائدة.
إضافة الفيروس واحد X برنامج تلفزيوني إلى أنبوب Microfuge 1.5 ملليلتر. دوامة الأنبوب في أدنى إعداد لتعليق تماما الفيروس. تدور أسفل الأنبوب في جهاز طرد مركزي منضدة مصغرة لمدة خمس إلى 10 ثوان لإزالة الفقاعات.
إضافة 30 ميكروليتر من الفيروس إلى كل بئر من 12 لوحة جيدا. دوامة لوحة ومن ثم الطرد المركزي العينات في 1000 مرات G لمدة 20 دقيقة. ضع لوحة 12 بئرًا في حاضنة درجة مئوية 37 بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي، تبادل وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ES جديدة والسماح للعدوى أن تحدث لمدة 48 ساعة. بعد 48 ساعة من العدوى، حدد للخلايا التي دمجت البلازميد الفيروسي عن طريق إضافة المضاد الحيوي المناسب. تغيير الوسائط يومياً.
الحفاظ على وسائل الإعلام اختيار على الخلايا لمدة 72 إلى 96 ساعة في حاضنة درجة مئوية 37 مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. الاستمرار في تعديل اللاجينية الكيميائية، أو CEM، وإعداد والعلاج عن طريق تعليق CEM مسحوق وكبريتيد ثنائي الفينيل، أو DMSO، إلى تركيز المخزون من ملليمولار واحد وتركيز العمل من 100 ميكرومولار. بعد أن خضعت الخلايا للاختيار لمدة 72 إلى 96 ساعة ، قسمت mESC إلى تنسيق 12 جيدًا مع 100،000 خلية في البئر.
احتضان الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة، وإعداد حل وسائل الإعلام من 100 نانومولار CEM مع وسائل الإعلام ES. استخدام وسائل الإعلام لتغذية mESC وكالة المخابرات المركزية مع ملليلتر واحد جيدا.
الحفاظ على جيدا من الخلايا دون أي CEM المضافة لتكون بمثابة عنصر تحكم. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط عن طريق التعرق في الوسائط القديمة وإضافة ملليلتر واحد لكل بئر من CEM الطازجة التي تحتوي على وسائط ES حرة أو CEM كل 24 ساعة لمدة التجربة. بعد 48 ساعة من العلاج CEM، صورة الخلايا دون CEM العلاج في الخلايا المعالجة مع 100 نانومولار CEM باستخدام المجهر المفلور.
التقاط صور تمثيلية باستخدام المرحلة أو حقل مشرق لتسجيل مورفولوجيا mESC في 10 إلى 40 مرة التكبير. يجب أن تكون الخلايا حول المستعمرات مع عدد قليل من الخلايا المتمايزة. تحت قناة فيت سي fluorescence، صورة كلا ظروف الخلية.
بعد ذلك ، عزل التحكم وCEM تعامل الخلايا لعملية استئصال الخلايا من خلال الاستنشاق الوسائط ، وغسل الخلايا بميليلتر واحد من X PBS ، وpirating PBS وإضافة 0.25 ملليلتر من 0.25 ٪ التربسين مع EDTA لمدة ثماني إلى 10 دقائق. تأكد من أن الخلايا لم تعد متجمعة في كتل كبيرة من خلال المجهر باستخدام التكبير 20 مرة. إذا كانت الخلايا لا يبدو أن في تعليق خلية واحدة، ماص بلطف لهم صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 لتسبيب الخلايا تماما.
إخماد التربسين مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الطازجة وإعادة تعليق الخلايا بسرعة عالية مع ماصات المصلية حتى الخلايا في تعليق خلية واحدة. ثم، تدور أسفل الخلايا في 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشعاعات الماثرة، وغسل الخلايا مع واحد X برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي الخلايا.
التعرق PBS supernatant و resuspend بيليه الخلية في 200 microliters من العازلة FACS. تنفيذ عملية استئصال الخلايا تدفق على ما يقرب من 50،000 الخلايا مع الخلايا المعلقة وتشغيل العينات بسرعة اغرم حوالي 5000 خلية في الثانية الواحدة. وأخيراً، قم بتصدير البيانات لمزيد من التحليل.
صور المرحلة من نظام CEM في مركز Oct4 وmESC وكالة المخابرات المركزية هي صورة بعد 48 ساعة من العلاج مع 100 نانومولار من CEM23 أو مع الخلايا غير المعالجة تشير إلى قمع GFP محددة. تُظهر الصور الفلورية تعبيرًا ساطعًا من GFP في خلايا التحكم وتعبيرًا مخفضًا عن GFP في mESC المعالج بـ CEM23. تدفق cytometry كشفت باستمرار عن انخفاض أكبر من 30 ٪ في التعبير GFP في وكالة المخابرات المركزية mESC تعامل مع 100 نانوموللار من CEM23 لمدة 48 ساعة.
Chromatin المناعي، أو CHIP، تبجح أن 48 ساعة من العلاج مع 100 نانومولار من CEM23 انخفض مستوى H3K27ac في مكان الهدف بالمقارنة مع الخلايا التحكم. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تكون حذراً مع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. إذا كانت التفريق أثناء البروتوكول، سيتم إبطال النتائج.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التركيبية لاستكشاف آليات vivo في الجينوم الثدييات.
