이 방법은 유전자 조절의 기계장치와 같은 후성 유전학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하고 다른 크로마틴 규제 요소 사이 원인 그리고 효력 관계를 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 처음으로 생리학적으로 관련된 내인성 효소로 크로마틴 로시를 모듈할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 마우스 ESL 문화가 본질적으로 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 방법의 추가 데모는 세포 바이러스 감염 단계가 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 연구원은 세포 배양의 2개의 개별적인 줄을 시간 해야 하 고 이러한 단계 동안 안전 감시 할 필요가 있다. 프로토콜을 시작하기 위해 50센티미터 플레이트당 293T HEK 셀 중 1,800만 개의 세포를 통과합니다.
이전 미디어를 흡인하고 하나의 X 인산염 완충식식염 또는 PBS의 10 밀리리터를 추가합니다. PBS를 흡인하고 0.05 %의 트립신의 세 밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 8분 동안 트립신에 세포를 배양합니다.
흔들고 잠복기를 통해 중간세포를 누릅니다. 다음 날, 세포가 60~80%에 도달하면 폴리에틸렌민 또는 PEI, 트랜스페션을 수행한다. 다음으로 DNA, PEI 및 트랜스페션 미디어를 15밀리리터 원내 튜브에 부드럽게 혼합합니다.
샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 15센티미터 플레이트에 액액을 드롭방향으로 추가합니다. 그런 다음, 5%의 이산화탄소를 가진 섭씨 37도 인큐베이터에서 16시간 동안 샘플을 배양합니다.
다음 날, 미디어를 흡인하고 15센티미터 플레이트에 미리 따뜻하고 신선한 293 HEK 미디어로 부드럽게 교체하십시오. 미디어 교환 후, 48 시간 동안 5 %의 이산화탄소와 37섭씨 인큐베이터에서 세포를 배양. 혈전계로 세포를 계산합니다.
통로는 이전에 감염하기 하루 전에 잘 100, 000 세포와 12 웰 플레이트 형식으로 mESC를 준비. 10센티미터 형식으로 자라는 세포의 경우, 이전 미디어를 흡인하고, X PBS 1개 5밀리리터를 추가하고, PBS를 흡수하고, 0.25%의 트립신1밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 8분 동안 트립신에 세포를 배양하고, 암석과 배양을 통해 중간쯤세포를 누릅니다.
미디어 교환 후 48시간 후, 293T HEK 세포의 상체를 제거하고 50 밀리리터 원추형 튜브로 이송한다. 상류분리기는 300배 G로 5분간 체전 파편을 환원합니다. 다음으로, 0.45 미크론 멤브레인을 통해 상체를 필터링합니다.
SW32 로터로 초원심분리기를 통해 바이러스를 농축하고 섭씨 4도에서 2시간 반 동안 72, 000배 G에서 샘플을 회전시합니다. 바이러스는 초음파 심립화의 밑에 집중하는 동안, 폴리브레인의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 포함하는 신선한 배아 줄기 또는 ES 매체를 가진 12 우물 판에서 CIA mESC의 취급합니다. 바이러스 농도가 완료되면, 신중하게 슈퍼 나탄을 흡인하고 조심스럽게 과도한 거품을 피하기 위해 하나의 X PBS의 100 마이크로 리터에서 바이러스 펠릿을 중단.
바이러스와 1개의 X PBS를 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 추가합니다. 바이러스를 완전히 중단하기 위해 가장 낮은 설정에서 튜브를 소용돌이. 미니 탁상 원심분리기에서 튜브를 5~10초 간 회전하여 거품을 제거합니다.
12 웰 플레이트의 각 웰에 바이러스의 30 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트를 소용돌이게 한 다음 샘플을 1000회 G에서 20분 동안 원심분리합니다. 12웰 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
다음 날 아침, 신선한 ES 미디어와 미디어를 교환하고 감염이 48 시간 동안 일어날 수 있도록하십시오. 감염 48 시간 후, 적절한 항생제를 추가하여 바이러스 플라스미드를 통합 한 세포를 선택하십시오. 매일 미디어를 변경합니다.
선택 매체를 37도 의 이산화탄소로 섭씨 37도인 에서 72~96시간 동안 셀에 보관하십시오. 화학 후성 유전학 수정자, 또는 CEM, 분말 CEM 및 디메틸 설산화물, 또는 DMSO를 중단하여 제조 및 치료를 계속, 하나의 밀리머의 재고 농도와 100 마이크로 몰러의 작업 농도. 세포가 72~96시간 동안 선택을 받은 후, mESC를 12개의 웰 형식으로 잘 분할하여 100, 000세포를 잘 입력합니다.
24시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도 의 섭씨 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후 ES 미디어를 통해 100나노몰러 CEM의 미디어 솔루션을 준비한다. 미디어를 사용하여 CIA mESC에 1 밀리리터를 잘 공급하십시오.
대조군 역할을 하기 위해 CEM을 첨가하지 않고 셀을 잘 유지하십시오. 다음으로, 실험 기간 동안 24시간마다 기존 미디어를 흡입하고 갓 준비된 CEM 또는 CEM 무료 ES 미디어를 통해 1밀리리터를 첨가하여 미디어를 변경합니다. 48시간의 CEM 치료 후, 형광 현미경을 이용하여 100나노몰러 CEM으로 처리된 세포에서 CEM 처리가 없는 세포를 이미지화한다.
위상 또는 밝은 필드를 사용하여 대표적인 이미지를 사용하여 mESC 형태를 10~40배 배율로 기록합니다. 세포는 몇몇 분화한 세포로 식민지 의 주위에 형성되어야 합니다. FITC 형광 채널에서 두 세포 상태를 이미지합니다.
다음으로, 미디어를 심도에 의하여 유동 세포에 대한 대조군 및 CEM 처리 세포를 분리하고, X PBS 1밀리리터로 세포를 세척하고, PBS를 흡입하고, EDTA를 사용하여 0.25%의 0.25%의 트립신을 8~10분 동안 첨가한다. 세포가 20배 배율을 사용하여 현미경을 통해 큰 덩어리로 더 이상 뭉치지 않다는 것을 확인합니다. 세포가 단일 셀 현탁액에 없는 것처럼 보이지 않으면 P1000 파이펫으로 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 완전히 트립시화합니다.
신선한 매체의 1 밀리리터로 트립신을 담금질하고 세포가 단일 세포 현탁액에 있을 때까지 혈청 피펫으로 세포를 고속으로 재연합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 300 배 G로 셀을 회전시하십시오. 수퍼나티를 흡인시키고, X PBS 로 세포를 씻고, 세포를 원심분리합니다.
PBS 슈퍼나탈을 흡인시키고 200마이크로리터의 FACS 버퍼에서 세포 펠릿을 재보아보세요. 일시 중단된 세포를 가진 약 50, 000 세포에 유동 세포측정을 수행하고 초당 약 5, 000 세포의 칼집 속도로 샘플을 실행합니다. 마지막으로 추가 분석을 위해 데이터를 내보냅니다.
10월 4일 궤적 및 CIA mESC의 CEM 시스템의 위상 이미지는 CEM23의 100 나노몰러 또는 처리되지 않은 세포로 48시간 동안 처리된 후에 특정 GFP 억압을 나타낸다. 형광 이미지는 대조군 세포에서 밝은 GFP 발현과 CEM23로 처리된 mESC에서 감소된 GFP 발현을 보여준다. 유동 세포측정은 CIA mESC에서 48시간 동안 CEM23 100 나노몰라로 처리된 GFP 발현이 30% 이상 감소한 것으로 지속적으로 나타났다.
크로마틴 면역 침전물 또는 CHIP은 CEM23의 100 나노몰러를 가진 48시간의 치료가 대조세포에 비해 표적 궤적에서 H3K27ac의 수준을 감소시켰다는 것을 알게 되었다. 이 절차를 시도하는 동안, 마우스 배아 줄기 세포에 주의하는 것이 중요합니다. 프로토콜 중에 구분하면 결과가 무효화됩니다.
개발 후, 이 기술은 포유류 게놈에 있는 생체 내 기계장치를 탐구하는 합성 생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
