Bu yöntem, gen düzenleme mekanizmaları ve farklı kromatin düzenleyici unsurlar arasındaki neden-sonuç ilişkileri gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtalmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, ilk kez fizyolojik olarak ilgili endojen enzimlerle bir kromatin loci modülünün mümkün olmasıdır. Genellikle bu yönteme yeni yeni bireyler mücadele edecek, çünkü fare ESL kültürü teknikte eğitilemeyenler için doğal olarak zordur.
Hücre viral enfeksiyon adımları öğrenmek zor olduğu gibi bu yöntemin daha fazla gösteri önemlidir. Araştırmacı hücre kültürünün iki ayrı satır zaman gerekir ve bu adımlar sırasında güvenlik dikkatle izlemek için gereklidir. Protokolü başlatmak için, 50 santimetre plaka başına 293T HEK hücrelerinin 18 milyon geçiş.
Aspire eski medya ve bir X fosfat tamponlu salin veya PBS 10 mililitre ekleyin. PBS aspire ve 0.05% tripsin üç mililitre ekleyin. Hücreleri tripsin içinde 8 dakika 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Hücreyi küçmeden yarıyolda sallayıp dokunun. Ertesi gün, hücreler %60-80 biraraya geldiğinde, bir polietilenin veya PEI transfeksiyonu gerçekleştirin. Daha sonra, DNA, PEI ve transfeksiyon ortamını 15 mililitrelik konik bir tüpte hafifçe karıştırın.
Numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra çözeltiyi 15 santimetrelik plakaya damlacık ekleyin. Daha sonra, numuneyi %5 karbondioksitle 37 derece lik bir kantinde 16 saat kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, medya aspire ve yavaşça önceden ısıtılmış ile değiştirin, taze 293 HEK medya 15 santimetre plakaları. Medya değişiminden sonra hücreleri 37 derece lik bir kantinde 48 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Hücreleri hemositometreile say.
Passage daha önce 12 iyi plaka formatında 12 iyi plaka formatında 100, 000 hücre başına iyi bir gün önce enfeksiyon. 10 santimetre formatında yetişen hücreler için, eski ortama aspire edin, bir X PBS beş mililitre ekleyin, PBS aspire, ve 0.25% tripsin bir mililitre ekleyin. Hücreleri 8 dakika boyunca tripsin'de 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve kuluçkanın yarısına kadar hücrelere dokunun.
Medya değişiminden 48 saat sonra, 293T HEK hücrelerinin süpernatantını çıkarın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücre enkazını peletlemek için süpernatant'ı 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Daha sonra, 0,45 mikron membran üzerinden supernatant filtre.
Bir SW32 rotor ile ultracentrifuge ile virüs konsantre ve dört santigrat derece iki buçuk saat için 72, 000 kez G örnek spin. Virüs ultracentrifugation altında yoğunlaşırken, 12 iyi plaka taze embriyonik kök veya ES media Polybrene mililitre başına beş mikrogram içeren CIA mESC tedavi. Virüs konsantrasyonu bittiğinde, dikkatle supernatant aspire ve dikkatle aşırı kabarcıklar önlemek için bir X PBS 100 mikrolitre virüs pelet askıya.
1.5 mililitrelik Microfuge tüpüne virüs ve bir X PBS ekleyin. Virüsü tamamen askıya almak için tüpü en düşük ayarda girdap. Kabarcıkları kaldırmak için beş ila 10 saniye boyunca bir mini masa üstü santrifüj tüp aşağı spin.
12 kuyu plakaher kuyuya virüs 30 mikrolitre ekleyin. Plakayı döndürün ve örnekleri 1000 kez G'de 20 dakika santrifüj edin. 12 kuyu plakasını bir gecede 37 derece lik kantine geri yerleştirin.
Ertesi sabah, taze ES medya ile medya alışverişi ve enfeksiyon 48 saat boyunca gerçekleşmesine izin. Enfeksiyon 48 saat sonra, uygun antibiyotik ekleyerek viral plazmid entegre hücreleri için seçin. Medyayı her gün değiştirin.
Seçim ortamını hücrelerde %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir kantinde 72 ila 96 saat boyunca saklayın. Toz CEM ve dimetil sülfatoksit veya DMSO'yu bir milimolar stok konsantrasyonuna ve 100 mikromolar çalışma konsantrasyonuna askıya alarak kimyasal epigenetik değiştirici veya CEM ile devam edin. Hücreler 72 ila 96 saat seçim yapıldıktan sonra, mmC's 12 iyi formatında 100, kuyu başına hücreleri ile bölün.
Hücreleri 37 derece lik bir kuluçka makinesinde 24 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra ES media ile 100 nanomolar CEM'lik bir ortam çözümü hazırlayın. CIA mESC'yi bir mililitre kuyuyla beslemek için medyayı kullanın.
Herhangi bir cem olmadan hücrelerin bir kuyu tutun bir kontrol olarak hizmet vermektedir. Daha sonra, eski medyayı azarlayarak ve deney süresince her 24 saatte bir yeni hazırlanmış CEM içeren cem veya CEM içermeyen ES medyasından her bir mililitre ekleyerek ortamı değiştirin. 48 saatlik CEM tedavisinden sonra, 100 nanomolar CEM ile tedavi edilen hücrelerde CEM tedavisi olmayan hücreleri floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin.
mESC morfolojisini 10 ila 40 kat büyütme de kaydetmek için faz veya parlak alan kullanarak temsili görüntüler alın. Hücreler birkaç farklılaşmış hücre ile koloniler etrafında oluşmuş olmalıdır. FITC floresan kanalı altında, her iki hücre koşullarını görüntüleyin.
Daha sonra, kontrol ve CEM gaz hücreleri akış sitometri sitometri için medya aspirating tarafından izole, bir X PBS bir mililitre ile hücreleri yıkama, PBS aspirating ve edta ile 0.25% 0.25 tripsin ekleyerek sekiz ila 10 dakika. Hücrelerin artık mikroskop aracılığıyla 20 kat büyütme kullanarak büyük kümeler halinde demetlenmediğini doğrulayın. Hücreler tek bir hücre süspansiyonunda görünmüyorsa, hücreleri tam olarak denemek için p1000 pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
Bir mililitre taze ortamla tripsini söndürün ve hücreler tek hücreli süspansiyona gelene kadar serolojik pipetle hücreleri yüksek hızda yeniden askıya alın. Daha sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca hücreleri 300 kez G'de aşağı doğru çevirin. Süpernatant aspire, bir X PBS ile hücreleri yıkayın ve hücreleri santrifüj.
PBS supernatant aspire ve FACS tampon 200 mikrolitre hücre pelet resuspend. Askıda hücrelerle yaklaşık 50.000'den fazla hücre üzerinde akış sitometrisi yapın ve örnekleri saniyede yaklaşık 5.000 hücrelik bir kılıf hızında çalıştırın. Son olarak, daha fazla analiz için veri dışa aktarın.
Oct4 locus ve CIA mESC'deki CEM sisteminin faz görüntüleri, 100 nanomolar CEM23 veya işlenmemiş hücrelerle 48 saatlik tedaviden sonra görüntülenir ve spesifik GFP baskısına işaret eder. Floresan görüntüler, kontrol hücrelerinde parlak bir GFP ifadesi ve MESC'nin CEM23 ile tedavi edilen gfp ifadesinde azaltılmış bir Ifade gösterir. Akış sitometrisi, CIA mESC'nin 48 saat boyunca 100 nanomolar CEM23 ile tedavi edilen GFP ekspresyonunda %30'dan fazla bir azalma olduğunu gösterdi.
Kromatin immünopresipite, veya CHIP, cem23 100 nanomolar ile tedavi 48 saat kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında hedef lokus h3K27ac düzeyini azalttı reveled. Bu işlemi denerken, fare embriyonik kök hücreleri ile dikkatli olmak hatırlamak önemlidir. Protokol sırasında farklılaşırlarsa, sonuçlar geçersiz kılınur.
Bu teknik, geliştirildikten sonra sentetik biyoloji alanındaki araştırmacıların memeli genomundaki in vivo mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.
