Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, como los mecanismos de regulación genética y las relaciones de causa y efecto entre los diferentes elementos reguladores de la cromatina. La principal ventaja de esta técnica es que por primera vez es posible módulor un loci de cromatina con enzimas endógenas fisiológicamente relevantes. Generalmente los individuos nuevos en este método lucharán porque la cultura de LA ESL del ratón es inherentemente difícil para aquellos que no han sido entrenados en la técnica.
La demostración adicional de este método es fundamental, ya que los pasos de infección viral celular son difíciles de aprender. El investigador debe cronolar dos líneas separadas de cultivo celular y es necesario vigilar vigilantemente la seguridad durante estos pasos. Para comenzar el protocolo, pasaje 18 millones de células HEK 293T por placa de 50 centímetros.
Aspirar los medios antiguos y añadir 10 mililitros de una solución salina tamponada de fosfato X, o PBS. Aspirar el PBS y añadir tres mililitros de 0.05%trypsin. Incubar las células en tripina durante ocho minutos a 37 grados centígrados.
Estrey golpea las células a mitad de la incubación. Al día siguiente, cuando las células hayan alcanzado entre el 60 y el 80% de confluencia, realice una transfección de polietilenimina, o PEI. A continuación, mezcle suavemente el ADN, el PEI y los medios de transfección en un tubo cónico de 15 mililitros.
Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de la incubación, añada la solución por gotas a la placa de 15 centímetros. Luego, incubar la muestra durante 16 horas en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, aspirar el medio y reemplazarlo suavemente con medios 293 HEK precalificados y frescos a las placas de 15 centímetros. Después del intercambio de medios, incubar las células en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Cuente las células con un hemocicómetro.
Pasar mESC previamente preparado a un formato de placa de 12 pozos con 100.000 células por pozo un día antes de la infección. Para las células cultivadas en un formato de 10 centímetros, aspirar el medio antiguo, añadir cinco mililitros de un X PBS, aspirar el PBS, y añadir un mililitro de 0.25%trypsin. Incubar las células en tripina durante ocho minutos a 37 grados Celsius y balancear las células a mitad de la incubación.
48 horas después del intercambio de medios, retire y transfiera el sobrenadante de las células HEK 293T a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el sobrenadante a 300 veces G durante cinco minutos para peletizar los desechos celulares. A continuación, filtre el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 micras.
Concentrar el virus a través de ultracentrífuga con un rotor SW32 y girar la muestra a 72.000 veces G durante dos horas y media a cuatro grados centígrados. Mientras que el virus se concentra bajo ultracentrifugación, tratar el mESC de la CIA en la placa de 12 pozos con tallo embrionario fresco o medios ES que contienen cinco microgramos por mililitro de Polibrona. Cuando la concentración del virus haya terminado, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y suspender cuidadosamente el pellet del virus en 100 microlitros de un PBS X para evitar el exceso de burbujas.
Agregue el virus y un X PBS a un tubo de microfugo de 1,5 mililitros. Vórtice el tubo en el ajuste más bajo para suspender completamente el virus. Gire hacia abajo el tubo en una mini centrífuga de mesa durante cinco a 10 segundos para eliminar las burbujas.
Añadir 30 microlitros del virus a cada pozo de una placa de 12 pozos. Gire la placa y luego centrifuga las muestras a 1000 veces G durante 20 minutos. Coloque la placa de 12 pozos en la incubadora de 37 grados Celsius durante la noche.
A la mañana siguiente, cambie los medios de comunicación con medios NUEVOS de ES y permita que la infección se lleve a cabo durante 48 horas. Después de 48 horas de infección, seleccione las células que integraron el plásmido viral añadiendo el antibiótico adecuado. Cambie los medios todos los días.
Mantenga el medio de selección en las células durante 72 a 96 horas en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Continúe con la preparación y el tratamiento epigenético químico, o CEM, suspendiendo el CEM en polvo y el sulfóxido dimetil, o DMSO, a una concentración de existencias de un milimolar y una concentración de trabajo de 100 micromolares. Después de que las células hayan sido seleccionadas de 72 a 96 horas, divida los mESC en un formato de 12 pozos con 100.000 celdas por pozo.
Incubar las células en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de la incubación, preparar una solución multimedia de 100 nanomolarES CEM con medios ES. Utilice los medios para alimentar bien al MESC de la CIA con un mililitro.
Mantenga un pozo de células sin ningún CEM agregado para servir como un control. A continuación, cambie los medios aspirando los medios antiguos y añadiendo un mililitro por CEM recién preparado que contenga o medios ES libres de CEM cada 24 horas durante el experimento. Después de 48 horas de tratamiento con CEM, úselas por imágenes de las células sin tratamiento cem en las células tratadas con 100 CEM nanomolares utilizando un microscopio de fluorescencia.
Tome imágenes representativas utilizando fase o campo brillante para registrar la morfología mESC en aumento de 10 a 40 veces. Las células deben haberse formado alrededor de colonias con algunas células diferenciadas. Bajo el canal de fluorescencia FITC, imagine ambas condiciones de celda.
A continuación, aísle las células de control y las células tratadas con CEM para la citometría de flujo aspirando los medios, lavando las células con un mililitro de un PBS X, aspirando el PBS y añadiendo 0,25 mililitros de 0,25% de trippsina con EDTA durante ocho a 10 minutos. Confirme que las células ya no están agrupadas en grandes grupos a través del microscopio usando un aumento 20 veces. Si las células no parecen estar en una sola suspensión de celda, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 para probar completamente las células.
Aprieta la tripina con un mililitro de medios frescos y resuspenda las células a alta velocidad con una pipeta serológica hasta que las células estén en una sola suspensión celular. Luego, gire hacia abajo las células a 300 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, lavar las células con un X PBS y centrifugar las células.
Aspirar el sobrenadante PBS y resuspender el pellet celular en 200 microlitros de tampón FACS. Realice la citometría de flujo en aproximadamente más de 50.000 células con las células suspendidas y ejecute las muestras a una velocidad de vaina de alrededor de 5.000 células por segundo. Por último, exporte los datos para su posterior análisis.
Las imágenes de fase del sistema CEM en el locus Oct4 y las de la CIA mESC se imán después de 48 horas de tratamiento con 100 nanomolares de CEM23 o con células no tratadas indican represión específica de la GFP. Las imágenes fluorescentes muestran una expresión de GFP brillante en las celdas de control y una expresión de GFP reducida en los mESC tratados con CEM23. La citometría de flujo reveló consistentemente una disminución superior al 30% en la expresión de GFP en los tratamientos de la CIA mESC con 100 nanomolares de CEM23 durante 48 horas.
La inmunoprecipitación de cromatina, o CHIP, se deleitaron con que 48 horas de tratamiento con 100 nanomolares de CEM23 disminuyeron el nivel de H3K27ac en el locus objetivo en comparación con las células de control. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado con las células madre embrionarias de ratón. Si se diferencian durante el protocolo, los resultados se anularán.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología sintética exploraran los mecanismos in vivo en el genoma de los mamíferos.
