Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen der Genregulation und Ursache-Wirkung-Beziehungen zwischen verschiedenen Chromatin-Regulierungselementen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es erstmals möglich ist, einen Chromatin-Loci mit physiologisch relevanten endogenen Enzymen zu modulieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode haben, Schwierigkeiten haben, weil die EsL-Kultur der Maus von Natur aus schwierig für diejenigen ist, die nicht in der Technik geschult wurden.
Eine weitere Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Virusinfektion in der Zelle schwer zu erlernen sind. Der Forscher muss zwei getrennte Linien der Zellkultur Zeit, und es ist notwendig, die Sicherheit während dieser Schritte wachsam zu überwachen. Um das Protokoll zu beginnen, Durchgang 18 Millionen von 293T HEK-Zellen pro 50 Zentimeter Platte.
Aspirieren Sie die alten Medien und fügen Sie 10 Milliliter einer X Phosphat gepufferte Saline, oder PBS. Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie drei Milliliter 0,05%Trypsin. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für acht Minuten bei 37 Grad Celsius.
Gestein und tippen Sie die Zellen auf halbem Weg durch die Inkubation. Am nächsten Tag, wenn die Zellen 60 bis 80% Konfluenz erreicht haben, führen Sie eine Polyethylenimin-, oder PEI-Transfektion durch. Als nächstes mischen Sie die DNA-, PEI- und Transfektionsmedien vorsichtig in einem 15 Milliliter konischen Rohr.
Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Nach der Inkubation tropfenweise die Lösung auf die 15-Zentimeter-Platte geben. Dann inkubieren Sie die Probe für 16 Stunden in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
Am nächsten Tag die Medien ansaugen und sanft durch vorgewärmte, frische 293 HEK-Medien an den 15 Zentimeter großen Platten ersetzen. Nach dem Medienaustausch die Zellen in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 48 Stunden inkubieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
Passage zuvor vorbereitet mESC in ein 12 Well-Platte-Format mit 100. 000 Zellen pro Brunnen einen Tag vor der Infektion. Für Zellen, die im 10-Zentimeter-Format angebaut werden, die alten Medien ansaugen, fünf Milliliter eines X-PBS hinzufügen, die PBS ansaugen und einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für acht Minuten bei 37 Grad Celsius und gesteinigen und tippen Sie die Zellen auf halbem Weg durch die Inkubation.
48 Stunden nach dem Medienaustausch den Überstand der 293T HEK-Zellen entfernen und in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 mal G für fünf Minuten, um den Zellabfall zu pellet. Filtern Sie als Nächstes den Überstand durch eine 0,45-Mikron-Membran.
Konzentrieren Sie das Virus über Ultrazentrifuge mit einem SW32-Rotor und drehen Sie die Probe bei 72.000-fachem G für zweieinhalb Stunden bei vier Grad Celsius. Während sich das Virus unter Ultrazentrifugation konzentriert, behandeln Sie die CIA-mESC in der 12-Well-Platte mit frischem embryonalen Stamm oder ES-Medien, die fünf Mikrogramm pro Milliliter Polybren enthalten. Wenn die Viruskonzentration beendet ist, saugen Sie den Überstand sorgfältig an und setzen Sie das Viruspellet vorsichtig in 100 Mikroliter eines X PBS aus, um überschüssige Blasen zu vermeiden.
Fügen Sie das Virus und ein X PBS zu einem 1,5 Milliliter Mikrofuge Tube. Wirbeln Sie die Röhre bei der niedrigsten Einstellung, um das Virus vollständig auszusetzen. Drehen Sie das Rohr in einer Mini-Tischzentrifuge für fünf bis zehn Sekunden, um Blasen zu entfernen.
Fügen Sie 30 Mikroliter des Virus zu jedem Brunnen einer 12 Brunnenplatte hinzu. Die Platte verwirbeln und dann die Proben 20 Minuten lang bei 1000-fachm G zentrieren. Legen Sie die 12 Well-Platte über Nacht wieder in den 37 Grad Celsius Inkubator.
Tauschen Sie am nächsten Morgen die Medien mit frischen ES-Medien aus und lassen Sie eine Infektion für 48 Stunden hinnehmen. Nach 48 Stunden Infektion, wählen Sie für Zellen, die das virale Plasmid durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikum integriert. Ändern Sie die Medien täglich.
Halten Sie die Selektionsmedien auf den Zellen für 72 bis 96 Stunden in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Fahren Sie mit dem chemischen epigenetischen Modifikator oder CEM fort, indem Sie das pulverisierte CEM und Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Lagerkonzentration von einem Millimolar und eine Arbeitskonzentration von 100 Mikromolaren aussetzen. Nachdem die Zellen 72 bis 96 Stunden lang ausgewählt wurden, teilen Sie die mESC es in ein 12-Well-Format mit 100.000 Zellen pro Brunnen auf.
Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Nach der Inkubation eine Medienlösung von 100 Nanomolaren CEM mit ES-Medien vorbereiten. Verwenden Sie die Medien, um den CIA mESC mit einem Milliliter gut zu füttern.
Bewahren Sie einen Brunnen von Zellen ohne zusätzliche Cem es auf, um als Kontrolle zu dienen. Als nächstes ändern Sie die Medien, indem Sie die alten Medien anvisieren und für die Dauer des Experiments alle 24 Stunden einen Milliliter pro gut zubereitetem CEM-freien ES-Medien hinzufügen. Nach 48 Stunden CEM-Behandlung die Zellen ohne CEM-Behandlung in den mit 100 nanomolaren CEM behandelten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden.
Nehmen Sie repräsentative Bilder mit Phase oder Hellfeld auf, um die mESC-Morphologie bei der 10- bis 40-fachen Vergrößerung aufzuzeichnen. Die Zellen sollten sich um Kolonien mit einigen differenzierten Zellen gebildet haben. Bildnis unter dem FITC-Fluoreszenzkanal beide Zellbedingungen ab.
Als nächstes isolieren Sie die Kontroll- und CEM-behandelten Zellen für die Durchflusszytometrie, indem Sie die Medien ansipirieren, die Zellen mit einem Milliliter eines X-PBS waschen, die PBS ansipirieren und 0,25 Milliliter 0,25%Trypsin mit EDTA für acht bis zehn Minuten hinzufügen. Bestätigen Sie, dass die Zellen nicht mehr in großen Klumpen durch das Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung gebündelt sind. Wenn sich die Zellen nicht in einer Einzelzellsuspension zu befinden scheinen, pipettesiebe sie vorsichtig mit einer P1000 Pipette nach oben und unten, um die Zellen vollständig zu trypsinisieren.
Das Trypsin mit einem Milliliter Frischmedien ablöschen und die Zellen mit hoher Geschwindigkeit mit einer serologischen Pipette wieder aussetzen, bis sich die Zellen in einer Einzelzellsuspension befinden. Dann drehen Sie die Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit einem X PBS, und zentrifugieren Sie die Zellen.
Aspirieren Sie den PBS-Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Führen Sie die Durchflusszytometrie an etwa 50.000 Zellen mit den suspendierten Zellen durch und führen Sie die Proben mit einer Mantelgeschwindigkeit von etwa 5 000 Zellen pro Sekunde aus. Exportieren Sie schließlich die Daten für die weitere Analyse.
Phasenbilder des CEM-Systems am Okt4-Ort und cia mESC werden nach 48 Stunden Behandlung mit 100 Nanomolaren cem23 oder mit unbehandelten Zellen auf eine spezifische GFP-Repression hinweisen. Fluoreszierende Bilder zeigen eine helle GFP-Expression in den Steuerzellen und eine reduzierte GFP-Expression in der mit CEM23 behandelten mESC. Die Durchflusszytometrie zeigte durchweg eine um mehr als 30 % abnahme der GFP-Expression in der CIA mESC, die 48 Stunden lang mit 100 Nanomolaren von CEM23 behandelt wurde.
Chromatin-Immunpräzipitation, oder CHIP, schwelgte, dass 48 Stunden Behandlung mit 100 Nanomolar von CEM23 den Gehalt an H3K27ac am Zielort im Vergleich zu Kontrollzellen verringerten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, vorsichtig mit den embryonalen Stammzellen der Maus zu sein. Wenn sie sich während des Protokolls unterscheiden, werden die Ergebnisse für ungültig erklärt.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der synthetischen Biologie, um die In-vivo-Mechanismen im Säugetiergenom zu erforschen.
