Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da epigenética, como os mecanismos de regulação genética e relações de causa e efeito entre diferentes elementos regulatórios da cromatina. A principal vantagem dessa técnica é que pela primeira vez é possível módulo de um loci de cromatina com enzimas endógenas fisiologicamente relevantes. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão porque a cultura de ESL do rato é inerentemente difícil para aqueles que não foram treinados na técnica.
Uma demonstração adicional desse método é fundamental, pois as etapas de infecção viral celular são difíceis de aprender. O pesquisador deve cronometrar duas linhas separadas da cultura celular e é necessário monitorar vigilantemente a segurança durante essas etapas. Para iniciar o protocolo, a passagem de 18 milhões de células HEK 293T por placa de 50 centímetros.
Aspire a mídia antiga e adicione 10 mililitros de um soro fisiológico tamponado x, ou PBS. Aspire o PBS e adicione três mililitros de 0,05% de trippsina. Incubar as células em trippsina por oito minutos a 37 graus Celsius.
Balance e toque nas células no meio da incubação. No dia seguinte, quando as células atingiram 60 a 80% de confluência, realizam uma polietilenimina, ou PEI, transfecção. Em seguida, misture suavemente o DNA, PEI e a mídia de transfecção em um tubo cônico de 15 mililitros.
Incubar a amostra em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, adicione a solução dropwise à placa de 15 centímetros. Em seguida, incubar a amostra por 16 horas em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, aspire a mídia e substitua-a suavemente por mídia HEK pré-armada e fresca de 293 para as placas de 15 centímetros. Após a troca de mídia, incubar as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Conte as células com um hemócito.
Passagem previamente preparado mESC em um formato de placa de 12 poços com 100.000 células por poço um dia antes da infecção. Para células cultivadas em formato de 10 centímetros, aspire a mídia antiga, adicione cinco mililitros de um X PBS, aspire o PBS e adicione um mililitro de 0,25% de trippsina. Incubar as células em trippsina por oito minutos a 37 graus Celsius e balançar e tocar as células no meio da incubação.
48 horas após a troca de mídia, remova e transfira o supernatante das células HEK 293T para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o supernante a 300 vezes G por cinco minutos para pelotar os detritos celulares. Em seguida, filtrar o supernascer através de uma membrana de 0,45 míces.
Concentre o vírus através de ultracentrifuge com um rotor SW32 e gire a amostra a 72.000 vezes G por duas horas e meia a quatro graus Celsius. Enquanto o vírus se concentra sob ultracentrifugação, trate os mESC's da CIA na placa de 12 poços com haste embrionária fresca ou mídia ES contendo cinco microgramas por mililitro de Polibrene. Quando a concentração do vírus terminar, aspire cuidadosamente o supernascer e suspenda cuidadosamente a pelota do vírus em 100 microliters de um X PBS para evitar bolhas em excesso.
Adicione o vírus e um X PBS a um tubo microfuçado de 1,5 mililitro. Vórtice o tubo na configuração mais baixa para suspender totalmente o vírus. Gire o tubo em uma mini centrífuga de mesa por cinco a 10 segundos para remover bolhas.
Adicione 30 microliters do vírus a cada poço de uma placa de 12 poços. Gire a placa e, em seguida, centrifugar as amostras a 1000 vezes G por 20 minutos. Coloque a placa de 12 poços de volta na incubadora Celsius de 37 graus durante a noite.
Na manhã seguinte, troque a mídia com a mídia ES fresca e permita que a infecção ocorra por 48 horas. Após 48 horas de infecção, selecione para células que integraram o plasmídeo viral adicionando o antibiótico apropriado. Mude a mídia diariamente.
Mantenha a mídia de seleção nas células por 72 a 96 horas em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono. Continue com modificador epigenético químico, ou CEM, preparação e tratamento suspendendo o CEM em pó e o sulfoxida de dimetila, ou DMSO, a uma concentração de estoque de um mililitro e uma concentração de trabalho de 100 micromolar. Após as células terem sido seleção por 72 a 96 horas, divida os mESC's em um formato de 12 bem com 100.000 células por poço.
Incubar as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Após a incubação, prepare uma solução de mídia de 100 nanomolar CEM com mídia ES. Use a mídia para alimentar o mESC da CIA com um mililitro bem.
Mantenha um poço de células sem nenhum CEM adicionado para servir como controle. Em seguida, mude a mídia aspirando a mídia antiga e adicionando um mililitro por poço fora cem recém-preparado contendo ou cem mídia ES livre a cada 24 horas durante a duração do experimento. Após 48 horas de tratamento cem, imagem as células sem tratamento CEM nas células tratadas com 100 cem nanomolar usando um microscópio de fluorescência.
Faça imagens representativas usando fase ou campo brilhante para registrar a morfologia mESC em 10 a 40 vezes a ampliação. As células deveriam ter se formado ao redor de colônias com algumas células diferenciadas. Sob o canal de fluorescência FITC, imagem ambas as condições celulares.
Em seguida, isole o controle e as células tratadas cem para citometria de fluxo aspirando a mídia, lavando as células com um mililitro de um X PBS, aspirando o PBS e adicionando 0,25 mililitros de 0,25% trypsin com EDTA por oito a 10 minutos. Confirme que as células não estão mais agrupadas em grandes aglomerados através do microscópio usando 20 vezes a ampliação. Se as células não parecem estar em uma única suspensão celular, pipeta-as suavemente para cima e para baixo com uma pipeta P1000 para tentar totalmente as células.
Sacie a trippsina com um mililitro de mídia fresca e resuspense as células em alta velocidade com uma pipeta sorológica até que as células estejam em uma única suspensão celular. Em seguida, gire as células a 300 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Aspire o supernasce, lave as células com um X PBS, e centrifugar as células.
Aspire o supernatante PBS e resuspenja a pelota celular em 200 microliters de tampão FACS. Realize a citometria de fluxo em aproximadamente 50.000 células com as células suspensas e execute as amostras a uma velocidade de baia de cerca de 5.000 células por segundo. Por fim, exporte os dados para análise suplementar.
As imagens de fase do sistema CEM no lócus oct4 e no CIA mESC são imagens após 48 horas de tratamento com 100 nanomolar de CEM23 ou com células não tratadas indicam repressão específica do GFP. Imagens fluorescentes mostram uma expressão GFP brilhante nas células de controle e uma expressão de GFP reduzida no mESC tratado com CEM23. A citometria de fluxo revelou consistentemente uma redução maior do que 30% na expressão de GFP no tratamento do CIA mESC com 100 nanomolar de CEM23 por 48 horas.
A imunoprecipitação de cromatina, ou CHIP, revelou que 48 horas de tratamento com 100 nanomolar de CEM23 diminuíram o nível de H3K27ac no lócus alvo quando comparado com as células de controle. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter cuidado com as células-tronco embrionárias do rato. Se eles se diferenciarem durante o protocolo, os resultados serão anulados.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia sintética explorarem os mecanismos in vivo no genoma dos mamíferos.
