用化学表观修饰因子重定向细胞机械抑制基因转录

该方法有助于回答表观遗传学领域关键问题，如基因调控机制和不同染色质调控元素之间的因果关系。该技术的主要优点是，首次能够将染色质位点与生理上相关的内源酶进行模块。通常，对于尚未接受过此技术培训的小鼠 ESL 培养者来说，新方法的个体将难以为之挣扎。

这种方法的进一步演示是至关重要的，因为细胞病毒感染步骤是很难学习的。研究者必须对两条单独的细胞培养线进行时间，并且有必要在这些步骤中警惕地监控安全性。为了开始这个协议，每50厘米板通过1800万个293T HEK细胞。

吸气旧介质，加入 10 毫升的一个 X 磷酸盐缓冲盐水，或 PBS。吸气PBS，并添加三毫升0.05%的三辛尝试。在37摄氏度下在尝试性素中孵育细胞8分钟。

在孵育的中途摇动并敲击细胞。第二天，当细胞达到60%至80%的汇合时，执行聚乙酰胺，或PEI，转染。接下来，将脱氧核糖核酸、PEI 和转染介质轻轻混合在 15 毫升锥形管中。

在室温下孵育样品15分钟。孵育后，将溶液滴到15厘米的板中。然后，在37摄氏度的培养箱中用5%的二氧化碳孵育样品16小时。

第二天，吸气介质，轻轻地更换它与预谋，新鲜的293 HEK介质到15厘米板。媒体交换后，在37摄氏度的培养箱中孵育细胞，用5%的二氧化碳孵育48小时。用血细胞计计算细胞。

在感染前一天，通过先前准备的MESC进入12个井板格式，每井有10万个细胞。对于以 10 厘米格式生长的细胞，吸气旧介质，添加 5 毫升的 X PBS，吸气 PBS，并添加 1 毫升 0.25% trypsin。在37摄氏度下孵育在尝试性细胞8分钟，在孵化中途敲击细胞。

介质交换后 48 小时，取出 293T HEK 细胞的上经液并将其转移到 50 毫升锥形管中。将上一提液在300倍G下离心5分钟，以对细胞碎片进行颗粒状。接下来，通过0.45微米膜过滤上清液。

通过SW32转子通过超离心将病毒集中，在4摄氏度下将样品在72，000次G旋转两个半小时。当病毒集中在超离心下时，用每毫升多聚布雷恩含有5微克的新鲜胚胎茎或ES介质在12井板中治疗CIA MESC。当病毒浓度完成时，小心吸上一道活，小心地将病毒颗粒悬浮在100微升的X PBS中，以避免多余的气泡。

将病毒和一个X PBS添加到1.5毫升微模糊管中。在最低设置的管子漩涡完全挂起病毒。在迷你桌面离心机中旋转管，5 到 10 秒钟以清除气泡。

在12个井板的每个井中加入30微升病毒。旋转板，然后以 1000 次 G 离心样品 20 分钟。将 12 个井板放回 37 摄氏度的孵化器中过夜。

第二天早上，用新的ES媒体交换媒体，让感染发生48小时。感染48小时后，通过添加适当的抗生素，选择整合病毒质粒的细胞。每天更换媒体。

在37摄氏度的培养箱中，将选择介质在细胞上保持72至96小时，并吸收5%的二氧化碳。继续化学表观遗传改性剂（CEM）的制备和处理，将粉末状的 CEM 和二甲基硫化物（或DMSO"暂停为一毫摩尔和 100 微摩尔的工作浓度。经过72至96小时的选择后，将MESC的井分成12个井格式，每井有10万个细胞。

在37摄氏度的培养箱中孵育细胞，用5%的二氧化碳孵育24小时。孵育后，准备100纳米摩尔CEM的介质溶液与ES介质。使用介质为 CIA MESC 提供一毫升好食物。

在不添加任何 CEM 的情况下保持一个良好的细胞，以用作控制。接下来，在实验期间，每新鲜准备的 CEM 包含或 CEM 免费 ES 介质，每 24 小时添加一毫升，从而改变介质。经过 48 小时的 CEM 处理后，使用荧光显微镜对使用 100 纳米摩尔 CEM 处理的细胞中未进行 CEM 处理的细胞进行图像成像。

使用相位或亮场拍摄具有代表性的图像，以 10 到 40 倍的放大率记录 mESC 形态。细胞应该在殖民地周围形成，并有几个分化的细胞。在 FITC 荧光通道下，对两个细胞条件进行成像。

接下来，通过吸气介质，用一毫升的一毫升一个X PBS清洗细胞，吸气PBS，用EDTA加入0.25毫升0.25微蛋白，分离对照组和CEM处理的细胞进行流动细胞测量，8至10分钟。使用 20 倍的放大倍率确认细胞不再通过显微镜将大团块束成一体。如果细胞看起来不在单个细胞悬浮液中，用P1000移液器轻轻移液，以完全尝试细胞。

用一毫升新鲜介质淬火，用血清移液器高速悬浮细胞，直到细胞处于单个细胞悬浮状态。然后，在室温下以300倍G旋转细胞，5分钟。吸上一液，用一个X PBS清洗细胞，并离心机。

吸制PBS上流剂，并在200微升的FACS缓冲液中重新填充细胞颗粒。对大约5万多个带悬浮细胞的细胞进行流式细胞测量，以大约5000个细胞/秒的护套速度运行样本。最后，导出数据以作进一步分析。

在10月4日位点和CIA MESC的CEM系统的相位图像在经过48小时的治疗后，用100纳米摩尔的CEM23或未经处理的细胞成像显示特定的GP抑制。荧光图像显示控制细胞中的明亮的 GFP 表达，以及使用 CEM23 处理的 MESC 中减少的 GFP 表达。流细胞学一直显示，在CIA MESC的100纳米摩尔的CEM23治疗48小时内，GFP表达的降幅超过30%。

与对照细胞相比，色谱免疫沉淀（CHIP）对用100纳米摩尔的48小时治疗降低了靶点H3K27ac的水平。在尝试这个程序时，重要的是要记住要小心小鼠胚胎干细胞。如果它们在协议期间区分，结果将无效。

该技术开发后，为合成生物学领域的研究人员探索哺乳动物基因组中的体内机制铺平了道路。