يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج الجيني، وتحلل اللقاحات والتطعيم الجيني. ويسهل فهم و تعديل تفاعلات المضيفين المتجهات من ناقلات نقل الجينات في الفيروس الغدي، وهو النوع الأكثر استخداماً من ناقلات في التجارب السريرية حتى الآن. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن منقلبات الفيروس الغدي يمكن تعديلها على وجه التحديد بطريقة محددة للغاية في مواقف مختارة وإلى مدى متغير باستخدام الكيمياء البسيطة.
الآثار المترتبة على هذه التقنية يمتد نحو العلاج لأن ناقلات تعديل المضيف لا يمكن تحليلها فقط ولكن أيضا تحوير بطريقة موجهة نحو المريض. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة على التفاعلات المضيف ناقلات محددة، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لوضع العلامات وتتبع جزيئات الفيروس في الكائنات الحية، مثل الفئران. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال مع مزيج فريد من علم الفيروسات والكيمياء العضوية التي تتطلب معرفة عملية من كلا المجالين.
عرض خاص لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية لأن هنا طرق من الكيمياء العضوية تلبية أساليب من علم الأحياء الخلية وعلم الفيروسات، بما في ذلك الحيل التعامل مع المجال المحدد. لبدء هذا الإجراء تحضير كافة المخازن المؤقتة كما هو موضح في بروتوكول النص. وزن ملليلتر واحد لكل مخزن مؤقت متدرج للتحقق من كثافته.
بعد تعقيم كافة المخازن المؤقتة، قم بسد المخازن المؤقتة التي تحتوي على TCEP مع غاز الأرجون لمدة 30 ثانية لمنع أكسدة TCEP. تخزين قارورة تحتوي على مسحوق الصلبة اقتران moiety في أنابيب أكبر، كل مليئة وسادة من حبات هلام السيليكا، لمنع تراكم المياه التكثيف عند ذوبان القنينات. ضع هذه الأنابيب في مجفف.
إزالة الهواء في مجفف واستبدالها مع غاز الأرجون. ثم أغلق كل أنبوب بإحكام ونقله إلى حاوية أكبر مع حبات هلام السيليكا. بمجرد أن يتم نقل جميع الأنابيب، أغلق الحاوية.
تخزين الحاوية في 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. عندما تكون جاهزة للذوبان، ضع الحاوية في طبقة من حبات السيليكا في مجفف. السماح للحاوية إلى الدفء ببطء إلى درجة حرارة الغرفة ومن ثم فتح الحاوية.
عندما تصل الخلايا إلى التأثير المثالي للخلايا، وجمعها عن طريق كشط اللوحات ونقل المابير إلى أنابيب الطرد المركزي. تدور مع تعليق الخلية في 400 مرة G لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، إعادة تعليق بيليه الخلية في أربعة ملليلتر من العازلة AD التي تحتوي على 10 ملليمولار TCEP ونقل الحل الناتج إلى أنبوب 50 ملليلتر معقمة.
تجميد الحل في النيتروجين السائل، ثم ذوبانه في حمام مائي في 37 درجة مئوية. كرر هذه دورة ذوبان التجميد ثلاث مرات لإنقاذ الناقل. جهاز طرد مركزي في 5000 G و أربع درجات مئوية لمدة عشر دقائق.
في حين أن الطرد المركزي حدد أنبوبين للطرد المركزي للغاية للبدء في إعداد تدرجين متساويين لتدرجات كلوريد سيزيوم. إضافة ثلاثة ملليلتر من المرحلة السفلى إلى كل من هذه الأنابيب. وضع علامة على مستوى المرحلة السفلية على الأنبوب قبل تحميل المرحلة العليا.
ثم كومة بعناية خمسة ملليلتر من المرحلة العليا unto المرحلة السفلى، pipetting عليه ببطء شديد أسفل على طول جدران الأنبوب. عندما يتم إعداد التدرجات والطرد المركزي هو تحميل كامل عظمى من العينة بالتساوي على التدرجين. ملء المساحة المتبقية في كل أنبوب التدرج مع إعلان العازلة التي تحتوي على عشرة مللر TCEP التأكد من ملء الأنابيب على طول الطريق إلى الأعلى.
ضبط وزن الأنابيب المقابلة إلى فرق الوزن صفر. وتغيير جهاز الطرد المركزي لمدة 176000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد هذا، استخدم المشبك لإصلاح أنابيب الطرد المركزي فائقة واحدة إلى موقف.
التأكد من مغادرة المنطقة المحيطة بمستوى المرحلة الأدنى الذي تم وضع علامة عليه يمكن الوصول إليه. ضع مصباح عنق الأوز فوق الأنبوب. حول العلامة، عند الحدود بين المرحلتين السفلية والعليا، يجب أن يكون نطاق متميز مرئياً.
ثقب الأنبوب بإبرة، وpirerate الفرقة المتجه في حقنة لجمع المتجه. نقل فيرونات المتجهات التي تم جمعها إلى أنبوب 15 ملليلتر وحساب مقدار الركيزة اللازمة للزوابط المطلوبة على النحو المبين في بروتوكول النص. ثم، نقل حل متجه إلى أنبوب من الحجم المناسب.
والكمية المحسوبة من اقترانات مجمعات حل الأسهم. مزيج بلطف عن طريق دوران النفقات العامة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ضبط الحجم الإجمالي للمحلول المتجه إلى ستة ملليلترات عن طريق إضافة المخزن المؤقت Ad.
تنقية الناقل من moiety اقتران غير منقح باستخدام خطوة ثانية من كلوريد سيزيوم ملزمة كما هو مبين في بروتوكول النص. ثقب الأنبوب بإبرة وpirerate الفرقة المتجه في حقنة. نقل ناقلات التي تم جمعها إلى أنبوب 15 ملليلتر.
إذا كان الجمع من كل من أنابيب التدرج أقل من 2.5 ملليلتر، ضبط مستوى الصوت إلى 2.5 ملليلتر عن طريق إضافة Ad العازلة. قم بتحميل فيرونات المدمجة إلى عمود PD مساوٍ تمت ترقيته وتجاهل التدفق من خلاله. ثم أضف ثلاثة ملليلترات من المخزن المؤقت للعُدّ إلى العمود، ثمّ جمع التدفق من خلاله.
إضافة 333 ميكرولتر من الجلسرين إلى تدفق التي تم جمعها من خلال الحصول على التركيز النهائي من عشرة في المئة. تقسيم هذه إلى aliquots مناسبة. التأكد من تضمين aliquot من 20 ميكرولترتر لتحديد أكثر إحكاما من قبل قياس OD 260.
تخزين حل ناقلات في 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. وتشير النتائج التمثيلية للآثار على 293 خلية إلى أن إنتاج ناقلات العدوى ناجح. يجب أن تظهر الخلايا مورفولوجيا 40-48 ساعة بعد تلقيحها مع ناقل الفيروس.
ثم يتم استخدام الفضة الملطخة PHDS phage لتقييم كفاءة اقتران. يتم تشغيل ناقلات مع Cysteins أدخلت في قاعدة كابسومري بنتون مع كل من الهيكسون المعدلة وغير المعدلة. تظهر عصابات Hexon تحول يشير إلى تعديل ناجح لأكثر من 90 في المائة من مونومر لكل capsid.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم ضمان تقليل البيئة لجسيمات ناقلات غير مُمَذَدَّة. بعد التعديل ، جو منتظم مناسب. و يتعين على الحسابات المستندية الدقيقة أن تضمن التعديل الكمي لجميع جسيمات المتجهات.
تطوير هذه التقنية يساعد على البحث في مجال العلاج الجيني لمزيد من استكشاف استراتيجيات آمنة وناقصة لإيصال ناقلات. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل اقتران يغاندس لاستهداف أو الأصباغ الفلورية لوضع العلامات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل استخدام مستقبلات وتوزيع الحيوي. يرجى التأكد من الانصياع للمعالجة المعدلة وراثيا المحلية الخاصة بك وأنظمة سلامة العمل.
