يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة ببيولوجيا الجهاز الهضمي، مثل كيفية تغيير التغيرات في التعبير الجيني أو التحديات البيئية في وظيفة الأمعاء. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستغرق وقتا أقل وأسهل في التنفيذ من الطرق التقليدية لقياس عبور الأمعاء. في يوم الفحص ، يتم تغذية اليرقات بالطعام الذي يحتوي على ملصق فلوري ، وكما تأكل هذا الطعام ، ستتراكم التسمية في أمعائها.
بعد الرضاعة ، يتم شطفها وفصلها عن الطعام غير المأكول ويتم نقل كل يرقة إلى بئر من لوحة متعددة الآبار. البئر لديه قاع مخروطي بحيث عندما يتم إبطال البراز ، فإنه يقع في مركز البئر. الآن تذكر، هناك العديد من اليرقات في لوحة متعددة جيدا التي يمكن رصدها في وقت واحد باستخدام مطياف لوحة، والذي يقيس كمية البراز voided.
ومع إلغاء المزيد بمرور الوقت، تزداد الإشارة وفقًا لذلك. وبهذه الطريقة، لدينا طريقة عالية الإنتاجية لقياس عبور الأمعاء. في اليوم الرابع بعد الإخصاب ، يرش ملليغرامين من مسحوق يرقات الأسماك الغذائية على رأس الماء في كل طبق بيتري لإطعام اليرقات.
السماح لليرقات أربع ساعات للتغذية. بعد التغذية ، نقل جميع اليرقات إلى طبق كبير يحتوي على شطف الجنين الطازج. باستخدام ماصة مصلية 50 ملليلتر ، فراغ بلطف أكبر قدر ممكن من بقايا الطعام ، مع الحرص على عدم التقاط أي يرقات.
نقل اليرقات إلى طبق بيتري جديد يحتوي على 50 ملليلتر من وسط الجنين الطازج. كرر عملية التغذية والشطف والنقل لمدة يومين إضافيين. في اليوم السادس بعد الإخصاب، ابدأ في إعداد الطعام الفلورسنت بإضافة 200 ملليغرام من الطعام المجفف إلى زجاج ساعة طوله 10 سنتيمترات.
إضافة 300 ميكرولترات من تسمية الفلورسنت و 100 ميكرولترات من المياه ديوند ومزيج لفترة وجيزة. انشر اللصق الناتج في طبقة رقيقة على زجاج الساعة واسمح له بالجفاف في درجة حرارة الغرفة، في الظلام، لمدة ثماني ساعات على الأقل. بعد ذلك، كشط الخليط المجفف من زجاج الساعة.
سحقه إلى مسحوق وتخزينها في درجة حرارة الغرفة، في الظلام. في اليوم السابع بعد الإخصاب ، أطعم الطعام الفلورسنت لليرقات عن طريق رش ملليغرامين منه فوق الماء في كل طبق بيتري. السماح لليرقات أن تتغذى لمدة ساعتين.
وفي الوقت نفسه، إعداد حلول الجرعات المركزة عن طريق حل كل مركب اختبار في متوسط الجنين إلى تركيز الذي هو ضعف الجرعة المستهدفة مع حجم النهائي لا يقل عن 2.5 ملليلتر. في نهاية فترة التغذية، استخدم ماصة نقل لنقلها إلى طبق الشطف الكبير. شطف جميع اليرقات التي سبق وصفها مع كنس أكثر صرامة.
من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من بقايا الطعام الفلوري خلال الشطف النهائي لتقليل احتمال نقله عن غير قصد إلى لوحة 96-well. بعد شطف كل يرقة ، استخدم ماصة لسحبها مع 100 ميكرولتر من متوسط الجنين من طبق الشطف. الاستغناء عن اليرقة وكامل 100 ميكرولترات من المتوسط في بئر من البوليسترين 96 جيدا، المخروطية القاع، لوحة متعددة جيدا.
بمجرد نقل جميع اليرقات ، أضف 100 ميكرولترات من حلول الدوِّرة المعدة إلى الآبار المناسبة. بعد أن تم إضافة جميع حلول الجرعات، قم بتحميل اللوحة في مقياس الطيفي للصفحة. قياس الفلوريس من لوحة من أسفل، خمس مرات في تعاقب فوري، دون أن يهز لوحة.
وستُعيَّن أدنى قراءة من كل بئر على أنها تفلور أولي أثناء تحليل البيانات. احتضان لوحة في حوالي 28 درجة مئوية. كرر عملية القياس، وقراءة الفلوريسين كل 20 دقيقة لأول ساعتين بعد الدوس، والتحضين بين القراءات.
قياس الفلوريسنس كل 30 دقيقة للساعتين الثالثة والرابعة بعد الدوس ثم إجراء قياسات بالساعة لساعات من خمسة إلى ثمانية. احتضان اليرقات في 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، اقرأ الفلوريس في 24 ساعة بعد الدوس.
يستخدم هذا البروتوكول القياس الطيفي القائم على الألواح لتقييم عبور GI كبديل عالي الإنتاجية للتنظير المجهري الفلوري. يتم إنشاء النتائج التمثيلية مقارنة هاتين الطريقتين عن طريق تحليل الأسماك المعالجة بشكل متطابق على مدى فترة 24 ساعة بعد الإيدز. وكما رأينا هنا، ترتبط النتائج ارتباطاً وثيقاً، مع ميل سلبي لأن المجهر يقيس إشارة الفلورسينس المحتفظ بها وقياس الطيفي يقيس الإشارة المرسلة.
تحليل المركبات ذات الآليات المتباينة يكشف أنه بالمقارنة مع المركبات الضوابط المعالجة, الأتروبين و amitriptyline بطيئة GI العبور. ومن ناحية أخرى، يُنظر إلى تيغاسيلود وميتوكلوبراميد على أنهما يعجلان بوقت العبور. الاريثروميسين، الذي كان من المتوقع أن يسرع وقت العبور على أساس استجابة الثدييات، بدلا من ذلك ينظر إلى أن يكون أي تأثير على وقت عبور الأسماك حمار وحشي.
مزيد من التحليل يدل على أن الأتروبين يبطئ عبور GI, جرعة تعتمد, في يرقات الأسماك حمار وحشي. ولم يكن لأدنى جرعة تم اختبارها، وهي 042 من الميكرومولار، أي تأثير كبير. في حين أن كل من الجرعات العالية ينظر إلى أن يكون لها تأثير كبير.
هذه الطريقة لديها العديد من التطبيقات، بما في ذلك الكشف عن الآثار السامة GI من الأدوية أو المرشحين للأدوية، والنمذجة المرض، مثل متلازمة القولون العصبي، واكتشاف علاجات جديدة لمثل هذه الأمراض، فضلا عن اكتشاف المركبات الحركية الموالية.
