Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés concernant la biologie gastro-intestinale, comme la façon dont les changements d’expression génétique ou les défis environnementaux modifient la fonction intestinale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle prend moins de temps et est plus facile à exécuter que les méthodes traditionnelles de mesure du transit intestinal. Le jour de l’analyse, les larves sont nourries d’aliments contenant une étiquette fluorescente, et au fur et à mesure qu’elles mangent cet aliment, l’étiquette s’accumule dans leur intestin.
Après l’alimentation, ils sont rincés, séparés des aliments non tenten et chaque larve est transférée dans un puits d’une assiette multi-puits. Le puits a un fond conique de sorte que lorsque la matière fécale est annulée, il tombe au centre du puits. Rappelez-vous maintenant, il y a beaucoup de larves dans la plaque multi-puits qui peuvent être surveillées simultanément à l’aide d’un spectrophotomètre de plaque, qui mesure la quantité de matière fécale annulée.
Et comme plus est annulé au fil du temps, le signal augmente en conséquence. De cette façon, nous avons une méthode à haut débit pour mesurer le transit intestinal. Le quatrième jour après la fécondation, saupoudrer deux milligrammes de nourriture en poudre de poisson larvaire sur le dessus de l’eau dans chaque boîte de Pétri pour nourrir les larves.
Laissez les larves se nourrir pendant quatre heures. Après l’alimentation, transférer toutes les larves dans un grand plat de rinçage contenant du milieu embryonnaire frais. À l’aide d’une pipette sérologique de 50 millilitres, videz doucement autant de restes de nourriture que possible, en prenant soin de ne pas capturer de larves.
Transférer les larves dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 50 millilitres de milieu embryonnaire frais. Répétez le processus d’alimentation, de rinçage et de transfert pendant deux jours supplémentaires. Le sixième jour après la fécondation, commencer à préparer les aliments fluorescents en ajoutant 200 milligrammes d’aliments séchés à un verre de montre de 10 centimètres.
Ajouter 300 microlitres d’étiquette fluorescente et 100 microlitres d’eau déionisée et mélanger brièvement. Étendre la pâte résultante en une fine couche sur le verre de la montre et lui permettre de sécher à température ambiante, dans l’obscurité, pendant au moins huit heures. Après cela, racler le mélange séché du verre de montre.
Écrasez-le en poudre et conservez-le à température ambiante, dans l’obscurité. Le septième jour après la fécondation, nourrir les larves de la nourriture fluorescente en saupoudrant deux milligrammes de celui-ci sur le dessus de l’eau dans chaque boîte de Pétri. Laissez les larves se nourrir pendant deux heures.
Pendant ce temps, préparer les solutions de dosage concentré en dissolvant chaque composé d’essai dans l’embryon moyen à une concentration qui est deux fois la dose cible avec un volume final d’au moins 2,5 millilitres. À la fin de la période d’alimentation, utiliser une pipette de transfert pour les déplacer vers un grand plat de rinçage. Rincez toutes les larves décrites précédemment avec un aspirateur plus rigoureux.
Il est important d’enlever autant de restes d’aliments fluorescents que possible pendant le rinçage final afin de réduire la possibilité qu’ils soient transférés par inadvertance dans l’assiette de 96 puits. Après que chaque larve est rincée, a utilisé une pipette pour la retirer avec 100 microlitres de milieu embryonnaire du plat de rinçage. Distribuez la larve et l’ensemble des 100 microlitres de milieu dans un puits d’une plaque de 96 puits en polystyrène, à fond conique et multi-puits.
Une fois que toutes les larves ont été transférées, ajouter 100 microlitres des solutions de dosage préparées aux puits appropriés. Après que toutes les solutions de dosage ont été ajoutées, chargez la plaque dans un spectrophotomètre de plaque. Mesurer la fluorescence de la plaque par le bas, cinq fois en succession immédiate, sans secouer la plaque.
La lecture la plus basse de chaque puits sera désignée comme sa fluorescence initiale lors de l’analyse des données. Incuber la plaque à environ 28 degrés Celsius. Répétez le processus de mesure, en lisant la fluorescence toutes les 20 minutes pendant les deux premières heures après le dosage, et en couveant entre les lectures.
Mesurez la fluorescence toutes les 30 minutes pendant les troisième et quatrième heures suivant le dosage, puis faites des mesures horaires pendant des heures cinq à huit heures. Incuber les larves à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lisez la fluorescence 24 heures après le dosage.
Ce protocole utilise la spectrophotométrie à base de plaques pour évaluer le transit gastro-intestinal comme un remplacement à haut débit pour la microscopie fluorescente. Les résultats représentatifs comparant ces deux méthodes sont générés par l’analyse de poissons traités de façon identique sur une période de 24 heures après le dosage. Comme on le voit ici, les résultats sont fortement corrélés, avec une pente négative parce que la microscopie mesure le signal de fluorescence retenu et la spectrophotométrie mesure le signal transmis.
L’analyse des composés avec des mécanismes disparates indique que par rapport aux commandes traitées par véhicule, l’atropine et l’amitriptyline ralentissent le transit gastro-intestinal. Tegaserod et metoclopramide, d’autre part, sont vus pour accélérer le temps de transit. On s’attend à ce que l’érythromycine, qui devait accélérer le temps de transit en fonction de la réponse des mammifères, n’ait aucune incidence sur le temps de transit des poissons zèbres.
Une analyse plus poussée démontre que l’atropine ralentit le transit gastro-intestinal, dose dépendante, chez les larves de poissons zèbres. La dose la plus basse testée, 042 micromolar, n’a eu aucun effet significatif. Alors que les deux doses plus élevées sont chacune considérées comme avoir un impact significatif.
Cette méthode a de nombreuses applications, y compris la détection des effets gastro-intestinaux toxiques des médicaments ou des candidats médicaments, la modélisation des maladies, telles que le syndrome du côlon irritable, la découverte de nouvelles thérapies pour ces maladies, ainsi que la découverte de composés pro-cinétiques.
