이 방법은 유전자 발현이 어떻게 변화하거나 환경 적인 도전이 창자 기능을 바꾸는가와 같은 위장 생물학에 관한 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있었습니다. 이 기술의 주요 장점은 장 간 운송을 측정하는 기존의 방법보다 시간이 적게 걸리고 실행하는 것이 더 쉽다는 것입니다. 분석 당일, 애벌레는 형광 라벨이 들어 있는 음식을 먹이며, 그 음식을 먹으면 라벨이 장에 축적됩니다.
먹이를 먹은 후, 그들은 헹구고, 먹지 않는 음식에서 분리되고 각 애벌레는 다중 우물 접시로 옮겨져 있습니다. 우물은 대변 물질이 무효화될 때 우물의 중앙에 떨어질 수 있도록 원물 바닥이 있습니다. 이제 기억, 여러 우물 플레이트에 많은 애벌레가 동시에 모니터링 할 수 있습니다 플레이트 분광계를 사용하여, 이는 무효 배설물의 양을 측정.
그리고 시간이 지남에 따라 더 많은 것이 무효화됨에 따라 그에 따라 신호가 증가합니다. 이러한 방식으로 장내 이동을 측정하는 높은 처리량 방법이 있습니다. 수정 후 4일째에, 각 페트리 접시에 물 위에 가루 애벌레 생선 사료 2밀리그램을 뿌려 애벌레를 먹입니다.
애벌레가 4시간 동안 먹이를 주도록 합니다. 먹이후 모든 애벌레를 신선한 배아 배지를 함유한 큰 헹구는 접시에 옮기는다. 50 밀리리터 세로지오테리언 파이펫을 사용하여 남은 음식을 가능한 한 많이 부드럽게 진공 청소하여 애벌레를 포획하지 않도록 주의하십시오.
신선한 배아 배지의 50 밀리리터를 포함하는 새로운 페트리 접시에 애벌레를 전송합니다. 2일 동안 먹이주기, 헹기 및 이송 과정을 반복합니다. 6일째에 수정 후, 10센티미터 시계 유리에 200밀리그램의 말린 식품을 추가하여 형광 식품을 준비하기 시작합니다.
300 마이크로리터의 형광 라벨과 100마이크로리터의 탈온화된 물을 넣고 짧게 섞어보습니다. 결과 페이스트를 시계 유리의 얇은 층으로 펴고 어둠 속에서 8시간 이상 실온에서 건조시키십시오. 그 후, 시계 유리에서 말린 혼합물을 긁어.
분말에 분쇄하고 어둠 속에서 실온에 보관하십시오. 7일째수정 후, 페트리 접시에 2밀리그램을 물 위에 뿌려 유충에 형광 식품을 먹이세요. 애벌레가 2시간 동안 먹이를 주도록 합니다.
한편, 배아 배지에서 각 시험 화합물을 용해하여 목표 용량의 2배 이상 인 농도로 농축 투약 용액을 준비하여 2.5 밀리리터이상의 최종 부피를 가진 다. 먹이 주기가 끝나면 이송 파이펫을 사용하여 큰 헹을 수있는 접시로 옮습니다. 이전에 더 엄격한 진공 청소기로 설명 된 모든 애벌레를 헹구는 다.
최종 헹구기 동안 남은 형광 식품을 가능한 한 많이 제거하여 실수로 96웰 플레이트로 옮겨질 가능성을 줄이는 것이 중요합니다. 각 애벌레가 헹구면 파이펫을 사용하여 헹구는 접시에서 배아 배지 100 마이크로리터와 함께 피펫을 사용했습니다. 유충과 전체 100 마이크로리터를 96웰의 폴리스티렌, 원물 바닥, 멀티웰 플레이트의 우물로 분배합니다.
모든 애벌레가 전달되면 준비된 투약 솔루션 100마이크로리터를 적절한 우물에 추가합니다. 모든 주입 솔루션이 추가된 후 플레이트를 분광포토미터에 적재합니다. 플레이트를 흔들지 않고 바닥에서 5번 연속적으로 형광을 측정합니다.
각 우물에서 가장 낮은 판독값은 데이터 분석 중에 초기 형광으로 지정됩니다. 약 28도에서 접시를 배양하십시오. 측정 과정을 반복하고, 처음 2시간 동안 20분마다 형광을 읽고, 읽기 사이에 배양합니다.
세 번째 와 네 번째 시간 후 투약에 대한 30 분마다 형광을 측정한 다음 시간당 측정을 5 ~ 8 시간 동안 합니다. 하룻밤 사이에 28도에서 유충을 배양하십시오. 다음 날, 24 시간 후 투약에서 형광을 읽으십시오.
이 프로토콜은 플레이트 기반 분광광법을 사용하여 형광 현미경 검사법을 위한 고처리량 대체체로 GI 전송을 평가합니다. 이 두 가지 방법을 비교하는 대표적인 결과는 24시간 동안 동일하게 처리된 물고기를 분석하여 생성됩니다. 여기서 볼 수 있듯이, 현미경 검사법은 유지된 형광 신호를 측정하고 분광광관측제가 전송된 신호를 측정하기 때문에 부정적인 경사와 함께, 결과는 매우 상관관계가 있다.
이질적인 메커니즘을 가진 화합물의 분석은 차량 처리 통제, 아트로핀 및 아미트립틸린 느린 GI 통과와 비교될 때 나타났습니다. 반면 테가세로드와 메토클로프라미드는 환승 시간을 가속화하는 것으로 보입니다. 포유류 의 반응에 따라 운송 시간을 가속화 할 것으로 예상된 에리스로 마이신은 대신 얼룩말 물고기 운송 시간에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다.
추가 분석은 atropine이 얼룩말 물고기 애벌레에서, 부양가족 복용량을 GI 전송을 느리게 한다는 것을 보여줍니다. 테스트 된 가장 낮은 복용량, 042 마이크로 몰러, 아무 의미 있는 효과 했다. 두 개의 더 높은 복용량은 각각 중요 한 영향을 볼 수 있는 동안.
이 방법은 약물 이나 약물 후보에서 독성 GI 효과 감지 를 포함 하 여 많은 응용 프로그램, 질병 모델링, 과민성 대 장 증후군 등, 이러한 질병에 대 한 새로운 치료의 발견, 그리고 프로 운동 화합물의 발견.
