Diese Methode könnte helfen, wichtige Fragen zur Magen-Darm-Biologie zu beantworten, wie z. B. wie sich die Genexpression verändert oder Umweltherausforderungen die Darmfunktion verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie weniger Zeit in Anspruch nimmt und einfacher auszuführen ist als herkömmliche Methoden zur Messung des Darmtransits. Am Tag des Testes werden Larven mit Lebensmitteln gefüttert, die ein fluoreszierendes Etikett enthalten, und wenn sie dieses Lebensmittel essen, wird sich das Etikett in ihrem Darm ansammeln.
Nach der Fütterung werden sie abgelegt, von nicht gegessener Nahrung getrennt und jede Larve in einen Brunnen mit einer Multi-Well-Platte überführt. Der Brunnen hat einen konischen Boden, so dass, wenn Fäkalien für ungültig erklärt werden, er in die Mitte des Brunnens fällt. Nun denken Sie daran, es gibt viele Larven in der Multi-Well-Platte, die gleichzeitig mit einem Plattenspektrophotometer überwacht werden können, das die Menge an entleerten Fäkalien misst.
Und da mehr im Laufe der Zeit für ungültig erklärt wird, erhöht sich das Signal entsprechend. Auf diese Weise haben wir eine Methode mit hohem Durchsatz zur Messung des Darmtransits. Am vierten Tag nach der Befruchtung zwei Milligramm Larvenfischfutter auf das Wasser in jeder Petrischale streuen, um die Larven zu füttern.
Lassen Sie die Larven vier Stunden zu füttern. Nach der Fütterung alle Larven auf eine große Spülschale mit frischem Embryomedium übertragen. Mit einer 50 Milliliter serologischen Pipette, sanft Vakuum so viel von der übrig gebliebenen Nahrung wie möglich, vorsichtig darauf achten, keine Larven zu fangen.
Larven auf eine neue Petrischale mit 50 Milliliter frischem Embryomedium übertragen. Wiederholen Sie den Fütterungs-, Spül- und Transfervorgang für zwei weitere Tage. Beginnen Sie am sechsten Tag nach der Befruchtung mit der Zubereitung der fluoreszierenden Nahrung, indem Sie 200 Milligramm getrocknete Nahrung zu einem 10-Zentimeter-Uhrenglas hinzufügen.
300 Mikroliter Fluoreszenzetikett und 100 Mikroliter entionisiertes Wasser hinzufügen und kurz mischen. Die resultierende Paste in eine dünne Schicht auf dem Uhrenglas verteilen und bei Raumtemperatur im Dunkeln mindestens acht Stunden trocknen lassen. Danach die getrocknete Mischung aus dem Uhrenglas kratzen.
Zerkleinern Sie es zu einem Pulver und lagern Sie es bei Raumtemperatur, im Dunkeln. Füttern Sie am siebten Tag nach der Befruchtung die fluoreszierende Nahrung an die Larven, indem Sie in jeder Petrischale zwei Milligramm davon auf das Wasser streuen. Lassen Sie die Larven für zwei Stunden füttern.
In der Zwischenzeit bereiten Sie die konzentrierten Dosierlösungen vor, indem Sie jede Testverbindung im Embryomedium auf eine Konzentration auflösen, die doppelt so hoch ist wie die Zieldosis mit einem Endvolumen von mindestens 2,5 Millilitern. Verwenden Sie am Ende der Fütterungszeit eine Transferpipette, um sie in eine große Spülschale zu bringen. Spülen Sie alle Larven, die zuvor mit strengerem Staubsaugen beschrieben wurden.
Es ist wichtig, so viel von den übrig gebliebenen fluoreszierenden Lebensmitteln wie möglich während der endlichen Spülung zu entfernen, um die Möglichkeit zu reduzieren, dass es versehentlich auf die 96-Well-Platte übertragen wird. Nachdem jede Larve gespült wurde, verwendet eine Pipette, um sie zusammen mit 100 Mikroliter embryonalen Mediums aus der Spülschale zu ziehen. Geben Sie die Larve und die gesamten 100 Mikroliter Medium in einen Brunnen eines 96-Well-Polystyrols, konisch-boden, Multi-Well-Platte.
Sobald alle Larven übertragen sind, fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Dosierlösungen in die entsprechenden Brunnen. Nachdem alle Dosierlösungen hinzugefügt wurden, laden Sie die Platte in ein Plattenspektrophotometer. Messen Sie die Fluoreszenz von der Platte von unten, fünfmal in unmittelbarer Folge, ohne die Platte zu schütteln.
Der niedrigste Wert aus jedem Brunnen wird als anfängliche Fluoreszenz während der Datenanalyse bezeichnet. Inkubieren Sie die Platte bei etwa 28 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Messvorgang, lesen Sie die Fluoreszenz alle 20 Minuten für die ersten zwei Stunden nach der Dosierung und inkubieren Zwischenlesevorgänge.
Messen Sie die Fluoreszenz alle 30 Minuten für die dritte und vierte Stunde nach der Dosing und machen Sie dann stündliche Messungen für Stunden fünf bis acht. Die Larven über Nacht bei 28 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag lesen Sie die Fluoreszenz bei 24 Stunden nach der Dosing.
Dieses Protokoll verwendet plattenbasierte Spektrophotometrie, um gi Transit als Hochdurchsatzersatz für fluoreszierende Mikroskopie zu bewerten. Repräsentative Ergebnisse, die diese beiden Methoden vergleichen, werden durch die Analyse identisch behandelter Fische über einen Zeitraum von 24 Stunden nach der Dosing generiert. Wie hier zu sehen, sind die Ergebnisse stark korreliert, mit einer negativen Steigung, da die Mikroskopie das zurückgehaltene Fluoreszenzsignal misst und die Spektrophotometrie das übertragene Signal misst.
Die Analyse von Verbindungen mit unterschiedlichen Mechanismen zeigt, dass im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Kontrollen Atropin und Amitriptin langsamen GI-Transit. Tegaserod und Metoclopramid hingegen werden gesehen, um die Transitzeit zu beschleunigen. Erythromycin, das die Transitzeit aufgrund der Reaktion von Säugetieren beschleunigen sollte, hat stattdessen keinen Einfluss auf die Transitzeit von Zebrafischen.
Weitere Analysen zeigen, dass Atropin den GI-Transit in Zebrafischlarven dosiert verlangsamt. Die niedrigste getestete Dosis, 042 Mikromolar, hatte keine signifikante Wirkung. Während die beiden höheren Dosen gesehen werden, um signifikante Auswirkungen haben.
Diese Methode hat viele Anwendungen, einschließlich der Erkennung toxischer GI-Effekte von Medikamenten oder Medikamentenkandidaten, Krankheitsmodellierung, wie Reizdarmsyndrom, Entdeckung neuer Therapien für solche Krankheiten, sowie die Entdeckung von pro-kinetischen Verbindungen.
