Bu yöntem, gen ekspresyonunun nasıl değiştiği veya çevresel zorlukların bağırsak işlevini nasıl değiştirdiği gibi gastrointestinal biyoloji ile ilgili anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, daha az zaman alması ve bağırsak geçişini ölçmenin geleneksel yöntemlerinden daha kolay uygulanmasıdır. Teşbe günü, larvalar floresan etiketi içeren yiyeceklerle beslenirler ve bu yiyeceği yerken, etiket bağırsaklarında birikir.
Beslendikten sonra durulanır, yenmemiş gıdalardan ayrılır ve her larva çok kuyulu bir tabak kuyuya aktarılır. Kuyunun konik bir alt kısmı vardır, böylece dışkı yok olduğunda kuyunun merkezine düşer. Unutma, çok kuyulu plakada aynı anda bir plaka spektrofotometresi kullanılarak izlenebilen birçok larva var. Bu da boşalan dışkı miktarını ölçüyor.
Ve daha fazla zaman içinde geçersiz, sinyal buna göre artar. Bu şekilde, bağırsak geçişini ölçmek için yüksek bir üretim yöntemine sahibiz. Döllenme sonrası dördüncü gün, larvaları beslemek için her Petri kabındaki suyun üzerine iki miligram toz larva balığı serpin.
Larvaların beslenmesine dört saat izin verin. Beslendikten sonra, taze embriyo orta içeren büyük bir durulama çanak tüm larvatransfer. 50 mililitrelik serolojik pipet kullanarak, kalan yiyeceklerin mümkün olduğunca çoğunu hafifçe vakumlayın, larvaları yakalamamaya dikkat edin.
Larvaları 50 mililitre taze embriyo ortası içeren yeni bir Petri kabına aktarın. Besleme, durulama ve aktarım işlemini iki gün daha tekrarlayın. Altıncı gün post-fertilizasyon, 10 santimetrelik saat cam 200 miligram kurutulmuş gıda ekleyerek floresan gıda hazırlamaya başlar.
Floresan etiket 300 mikrolitre ve deiyonize su 100 mikrolitre ekleyin ve kısaca karıştırın. Elde edilen hamuru saat camındaki ince bir tabaka halinde yayın ve oda sıcaklığında, karanlıkta en az sekiz saat kurumasını bekleyin. Bundan sonra, saat cam ından kurutulmuş karışımı kazıyın.
Bir toz ezmek ve oda sıcaklığında saklayın, karanlıkta. Döllenme sonrası yedinci günde, floresan yiyecekleri her Petri kabındaki suyun üzerine iki miligram serperek larvalara yedirin. Larvaların iki saat beslenmesine izin verin.
Bu arada, en az 2,5 mililitre son hacmi ile iki kez hedef doz bir konsantrasyon embriyo orta her test bileşiği eriterek konsantre dozlama çözümleri hazırlamak. Besleme süresinin sonunda, büyük bir durulama çanağı taşımak için bir transfer pipet kullanın. Daha önce daha sıkı vakumlama ile açıklanan tüm larvaları durula.
Bu yanlışlıkla 96-well plaka aktarılır olasılığını azaltmak için son durulama sırasında mümkün olduğunca fazla floresan gıda kaldırmak için önemlidir. Her larva durulandıktan sonra, durulama çanağı embriyo orta 100 mikrolitre ile birlikte çekmek için bir pipet kullanılır. Larvayı ve 100 mikrolitre orta litreyi 96 kuyulu polistiren, konik alt, çok kuyulu bir tablanın içine dağıtın.
Tüm larvalar transfer edildikten sonra, hazırlanan dosing çözeltilerinin 100 mikrolitresini uygun kuyulara ekleyin. Tüm dosing çözeltileri eklendikten sonra plakayı bir plaka spektrofotometresine yükleyin. Alttan plaka floresan ölçün, hemen arkaya beş kez, plaka sallayarak olmadan.
Her kuyudan en düşük okuma, veri analizi sırasında ilk floresan olarak belirlenecektir. Plakayı yaklaşık 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ölçüm işlemini tekrarlayın, ilk iki saat boyunca her 20 dakikada bir floresan okuyarak ve okumalar arasında kuluçkaya yatın.
Floresan'ı üçüncü ve dördüncü saat sonrası üçüncü ve dördüncü saat için her 30 dakikada bir ölçün ve ardından beş ila sekiz saat boyunca saatlik ölçümler yapın. Larvaları bir gecede 28 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, 24 saat sonra doktora floresan okuyun.
Bu protokol, floresan mikroskopi için yüksek iş çıkışlı bir değiştirme olarak GI transitini değerlendirmek için plaka bazlı spektrofotometri kullanır. Bu iki yöntemi karşılaştıran temsili sonuçlar, 24 saatlik bir işlem sonrası dönemde aynı şekilde işlenmiş balıkların analiz edilerek oluşturulur. Burada görüldüğü gibi, mikroskobik tutulan floresan sinyalini ölçterken ve spektrofotometri iletilen sinyali ölçtebildiği için sonuçlar negatif eğimle son derece ilişkilidir.
Farklı mekanizmalara sahip bileşiklerin analizi, araç tedavi kontrolleri, atropin ve amitriptirin yavaş GI transit ile karşılaştırıldığında ortaya koymaktadır. Tegaserod ve metoklopramid, diğer taraftan, transit süresini hızlandırmak için görülür. Memelilerin tepkisine bağlı olarak geçiş süresini hızlandırması beklenen eritromisinin bunun yerine zebra balıklarının geçiş süresini etkilemediği görülmektedir.
Daha ileri analizler, atropinin zebra balık larvalarında GI geçişini, dozbağımlı olarak yavaşlattettiğini göstermektedir. Test edilen en düşük doz, 042 mikromolar, önemli bir etkisi yoktu. Iki yüksek dozlar her önemli bir etkiye sahip olduğu görülür ken.
Bu yöntem, ilaç veya ilaç adaylarından toksik GI etkilerinin saptanarak, irritabl barsak sendromu, bu tür hastalıklar için yeni tedavilerin keşfi gibi hastalık modellemesi ve pro-kinetik bileşiklerin keşfi de dahil olmak üzere birçok uygulama vardır.
