Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии желудочно-кишечного тракта, такие как, как изменения экспрессии генов или экологические проблемы изменить функцию кишечника. Основным преимуществом этой техники является то, что она занимает меньше времени и легче выполнить, чем традиционные методы измерения транзита кишечника. В день анализа, личинки кормят пищу, содержащую флуоресцентные этикетки, и, как они едят эту пищу, этикетка будет накапливаться в их кишечнике.
После кормления их промывают, отделяют от несъеденной пищи, и каждая личинка переносится в колодец из нескольких хорошо пластин. Колодец имеет коническое дно, так что, когда фекалии аннулируются, он падает в центр колодец. Теперь помните, Что есть много личинок в многоясной пластины, которые могут контролироваться одновременно с помощью пластины спектрофотометр, который измеряет количество аннулированных фекалий.
И по мере того как больше аннулировано над временем, сигнал увеличивает соответственно. Таким образом, у нас есть высокий метод пропускной способности для измерения транзита кишечника. На четвертый день после оплодотворения, посыпать два миллиграмма порошкообразной личинок рыбы пищи на верхней части воды в каждой чашке Петри кормить личинок.
Дайте личинкам четыре часа накормить. После кормления перенесите все личинки в большое полоскать блюдо, содержащее свежий эмбрион среды. Используя 50 миллилитров серологического пипетки, аккуратно вакуум как можно больше остатков пищи, как это возможно, будьте осторожны, чтобы не захватить личинок.
Перенесите личинки в новую чашку Петри, содержащую 50 миллилитров свежей среды эмбриона. Повторите процесс кормления, полоскания и переноса еще на два дня. На шестой день после оплодотворения начните готовить флуоресцентную пищу, добавив 200 миллиграммов сушеной пищи в 10-сантиметровое часовое стекло.
Добавьте 300 микролитров флуоресцентной этикетки и 100 микролитров деионизированной воды и кратко перемешайте. Распространение результирующей пасты в тонкий слой на часы стекла и дайте ему высохнуть при комнатной температуре, в темноте, по крайней мере восемь часов. После этого соскребли высушенную смесь со стакана часов.
Измельчите его до порошка и храните при комнатной температуре, в темноте. На седьмой день после оплодотворения, кормить флуоресцентной пищи для личинок, опрыскивание два миллиграмма его на верхней части воды в каждой чашке Петри. Разрешить личинки кормить в течение двух часов.
Между тем, подготовить концентрированные дозирования решений путем растворения каждого испытательного соединения в эмбрионе среды до концентрации, которая в два раза целевой дозы с окончательным объемом не менее 2,5 миллилитров. В конце периода кормления используйте перенесите пипетки, чтобы переместить их в большое полосканое блюдо. Промыть все личинки ранее описанные с более строгим пылесосом.
Важно удалить как можно больше остатков флуоресцентной пищи, как это возможно во время окончательного полоскания, чтобы уменьшить вероятность того, что он непреднамеренно передается на 96-хорошо пластины. После того, как каждая личинка промыть, использовать пипетку, чтобы снять его вместе с 100 микролитров эмбриона среды из полоскания блюдо. Разпределите личинку и все 100 микролитров среды в колодец из 96-ну полистирола, конического дна, многоясной пластины.
После того, как все личинки были переданы, добавьте 100 микролитров подготовленных досинг решений для соответствующих скважин. После того, как все решения для досирования были добавлены, загрузите пластину в спектрофотометр пластины. Измерьте флуоресценцию от пластины снизу, пять раз подряд, не встряхивая пластину.
Самые низкие показания с каждой колодец будут обозначены как его начальная флуоресценция во время анализа данных. Инкубировать пластину примерно при 28 градусах по Цельсию. Повторите процесс измерения, читая флуоресценцию каждые 20 минут в течение первых двух часов после дозирования, и инкубации между читает.
Измерьте флуоресценцию каждые 30 минут в течение третьего и четвертого часов после досирования, а затем сделайте почасовые измерения в течение пяти-восьми часов. Инкубировать личинок при 28 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день прочитайте флуоресценцию в течение 24 часов после езды.
В этом протоколе используется спектрофотометрия на основе пластин для оценки транзита GI в качестве высокой пропускной способности для флуоресцентной микроскопии. Репрезентативные результаты, сравнивающие эти два метода, генерируются путем анализа одинаково обработанной рыбы в течение 24-часового периода после досирования. Как видно здесь, результаты сильно коррелируют, с отрицательным уклоном, потому что микроскопия измеряет сохраненный сигнал флуоресценции и спектрофотометрия измеряет передаваемый сигнал.
Анализ соединений с разрозненными механизмами показывает, что по сравнению с транспортным средством, обработанным управлением, атропин и амитриптилин замедляют транзит GI. Тегасерод и метоклопрамид, с другой стороны, как видно, ускоряют время транзита. Эритромицин, который, как ожидается, ускорит время транзита на основе реакции млекопитающих, вместо этого, как видно, не влияет на время транзита рыбы зебры.
Дальнейший анализ показывает, что атропин замедляет транзит GI, доза зависимо, в личинках рыб зебры. Самая низкая доза, проверенная, 042 микромолара, не имела существенного эффекта. Хотя две более высокие дозы каждый видел, чтобы иметь значительное влияние.
Этот метод имеет много применений, в том числе выявление токсических эффектов Г.И. от наркотиков или кандидатов на наркотики, моделирование заболеваний, таких как синдром раздраженного кишечника, открытие новых методов лечения таких заболеваний, а также открытие про-кинетических соединений.
