Este método pode ajudar a revelar as diferenças entre fungos e mamíferos a nível molecular. Tais diferenças podem ser aproveitadas para identificar novas abordagens terapêuticas. A principal vantagem desta técnica é que ela modifica mais eficientemente o genoma dos C.Albicans do que técnicas clássicas de recombinação homólogos.
Para identificar a sequência de RNA guia, identifique uma sequência DE GG PAM próxima de onde o códon de parada será inserido. Mostrado aqui, são todas as sequências PAM encontradas nos primeiros 100 pares base de TPK2, uma subunidade catalítica amp quinase cíclica. Identifique a sequência de guia para a frente três.
Esta sequência será de 20 bases diretamente a montante de um site NGG PAM e não conterá mais de cinco T's seguidos. Clique à esquerda na base diretamente rio acima do NGG e arraste as bases do cursor de 20. Em seguida, clique na guia primer para adicionar o primer.
Agora, identifique a primer de guia reversa três sequência, que será o elogio à sequência guia para a frente. Lamba na base diretamente rio acima do NGG e arraste as 20 bases do cursor. Para cada primer, clique na guia primer para adicionar o primer.
Clique com o botão direito do mouse no primer e selecione copiar dados do primer. Cole as sequências em um programa de edição de texto. Adicione sequências de saliência para guiar oligos para frente e reverter para facilitar a clonagem.
Adicione a sequência de nucleotídeos ATTTG à extremidade principal cinco da primer guia dianteira três e adicione G à extremidade principal do primer guia dianteiro três. Finalmente, na sequência nucleotídea AAAAC para a extremidade cinco prime do primer guia reverso três e adicionar C à extremidade três prime end do primer guia reverso três antes de comprar. Teste de corante o vetor de expressão cas9 otimizado candida adicionando pv1524, tampão de 10x, bs9b1 e água a 50 micro litros em um tubo de 1,5 mililitro e incubar a 55 graus Celsius por 20 minutos.
Esfrie a mistura de digestão à temperatura ambiente e gire por 30 segundos a 2348 vezes G para trazer condensação para o fundo do tubo. Para fosfatizar tratar a espinha dorsal digerida, adicione um microliter de fosfattase intestinal de bezerro à mistura de digestão. Incubar a reação a 37 graus Celsius por uma hora antes.
Agora, o primer de guia de fosforilato e anneal para a frente três e o primer guia reverso três, combinando-os com 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase, e água em um tubo PCR. Adicione 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase e Molecular Biology Grade Water a um segundo tubo PCR como um controle negativo. Incubar as misturas de reação em um Thermocycler a 37 graus Celsius por 30 minutos, depois a 95 graus Celsius por 5 minutos.
Esfrie a mistura na velocidade mais lenta para 16 graus Celsius para resfriar os oligos. Em seguida, incubar a mistura de oligo enaltado a 4 graus Celsius. Agora liga os oligos enaltados em PV1524 digerido.
No primeiro tubo PCR, adicione 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, mistura de oligo enlatada, plasmídeo purificado tratado CIP digerido e água a um volume total de 10 microliter. Da mesma forma, prepare um segundo tubo PCR usando a mistura de controle negativo em vez da mistura de oligo renascido. Incubar ambos os tubos em um Thermocycler a 16 graus Celsius por 30 minutos, depois a 65 graus Celsius por 10 minutos, e finalmente esfriar a 25 graus Celsius.
Após a ligadura, transforme as misturas de ligadura em células quimicamente competentes e, em seguida, purfique e sequencie os plasmídeos conforme descrito no protocolo de texto. Para projetar o modelo de reparo, insira um códon stop clicando na sequência genética e adicionando nucleotídeos que codificam um local de digestão stop codon e restriction. Clique esquerdo 10 bases a jusante de onde a mutação será feita e arraste o cursor 60 bases rio acima.
Lamba à esquerda na aba primer para adicionar o primer. Isso adicionará o modelo de reparo para frente três. Em seguida, clique 10 bases rio acima de onde a mutação será feita e arraste o cursor 60 bases rio abaixo.
Clique à esquerda na guia primer para adicionar o primer. Isso adicionará o modelo de reparo reverso três. Para gerar o modelo de reparo, adicione primer de modelo de reparo, primer reverso do modelo de reparo, triptosfatos desoxinucleotídeos, tampão, polimerase TACH e água para cada um dos quatro tubos PCR.
Agora execute a extensão do primer rodando entre 20 e 30 rodadas de PCR. Para digerir os plasmídeos corretamente clonados, adicione plasmídeos, 10x Buffer, Bovine Serum Albumin, KPN 1, SAC 1 e água para 40 microliters volume total em um tubo de 1,5 mililitro. Incubar a 37 graus Celsius durante a noite.
Enquanto isso, cresça uma cultura noturna de C.albicans SC5314, prototrófica selvagem, a 25 graus Celsius em uridina suplementada YPD. Cresça a cultura a uma densidade óptica a 600 nanômetros ou OD 600 de menos de seis. Pelota cinco OD 600 unidades de células por transformação girando por cinco minutos a 2348 vezes G.Em seguida, suspenda as células pelleted em 100 microliters de ACEtato de TE/Lítio.
Agora, a um tubo de 1,5 mililitro e em ordem, adicione as células re-suspensas, DNA de esperma de salmão cozido e resfriado rapidamente, a digestão plasmática, o modelo de reparo purificado, e tampão de placa. Prepare um controle negativo da mesma forma, exceto para substituir a água em um volume igual ao do DNA transformador. Depois de incubar as transformações durante a noite, o calor joga as células colocando-as em um banho de água de 44 graus Celsius por 25 minutos.
Gire por cinco minutos a 2348 vezes G em uma centrífuga superior de banco e remova a mistura de placa supernatante. Lave uma vez adicionando um mililitro de Uridine Supplemented YPD e centrífuga novamente. Depois de suspender as células em 0,1 mililitro de Uridine Supplemented YPD, incubar a suspensão em um tambor de rolo ou agitador a 25 graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, emplaque as células em Uridine Supplemented YPD com 200 microgramas por mililitro de nourseothricin. As colônias aparecerão em dois a cinco dias e devem ser listradas para colônias únicas, conforme descrito no protocolo de texto. Para executar o PCR da colônia, projete um primer de verificação para a frente cerca de 200 pares de base até o fluxo do site de restrição que foi introduzido, bem como um primer reverso aproximadamente 300 pares de base rio abaixo.
Adicione 0,3 microliters de primer de verificação dianteira, 0,3 microliters de primer de verificação reversa, 0,3 microliters de polimerase termoestável, três microliters de dNTP's, três microliters de tampão XTAC e 23 microliters de água para um tubo. Em seguida, adicione 0,25 microliters de uma única colônia de levedura à mistura usando uma ponta de pipeta P10 e tomando cuidado para não perturbar o ager. Depois de amplificar o DNA por PCR, execute cinco microliters do PCR no gel para garantir que a amplificação seja bem sucedida, tomando cuidado para não perturbar a pelota de detritos celulares na parte inferior do tubo.
Os resultados representativos para a edição de genoma mediado pelo CRISPR em C.Albicans são mostrados aqui. Os C.Albicans foram transformados com rnas guia e modelos de reparo que visam C.Albicans TPK2. Um local de digestão de restrição EcoR1 e códons de parada no modelo de reparo interrompem o site pam e facilitam a triagem para mutantes corretos.
O PCR da colônia seguido de digestão de restrição distingue rapidamente o tipo selvagem das sequências editadas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar várias cópias do guia RNAs clonados em PV1524. Como isso diminuirá a eficiência de edição de genomas.
Não se esqueça, os C.Albicans são um patógeno BL2, e sempre onde o traje de laboratório apropriado e siga todos os procedimentos de segurança durante a realização deste procedimento.
