Este método puede ayudar a revelar las diferencias entre hongos y mamíferos a nivel molecular. Estas diferencias se pueden aprovechar para identificar nuevos enfoques terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que modifica más eficientemente el genoma de C.Albicans que las técnicas clásicas de recombinación homóloga.
Para identificar la secuencia de ARN guía, identifique una secuencia NGG PAM cerca de donde se insertará el codón de parada. Aquí se muestran todas las secuencias PAM que se encuentran en los primeros 100 pares base de TPK2, una subunidad catalítica de la quinasa AMP cíclica. Identifique la primera secuencia de la guía directa tres.
Esta secuencia será de 20 bases directamente aguas arriba de un sitio de NGG PAM y no contendrá más de cinco T en una fila. Haga clic izquierdo en la base directamente aguas arriba del NGG y arrastre el cursor 20 bases. A continuación, haga clic izquierdo en la pestaña de imprimación para agregar la imprimación.
Ahora, identifique la primera guía inversa de tres secuencias, que será el cumplido con la secuencia de guía de avance. Lamer a la izquierda en la base directamente aguas arriba del NGG y arrastre el cursor 20 bases. Para cada imprimación, haga clic izquierdo en la pestaña de imprimación para agregar la imprimación.
Haga clic con el botón derecho en la imprimación y seleccione Copiar datos de imprimación. Pegue las secuencias en un programa de edición de texto. Agregue secuencias de voladizo a los oligos de guía hacia delante e inverso para facilitar la clonación.
Agregue la secuencia de nucleótidos ATTTG al extremo 5 de la imprimación de la guía directa tres y agregue G al extremo tres de la imprimación de la guía directa tres. Finalmente, en la secuencia de nucleótidos AAAAC al extremo 5 de la imprimación de la guía inversa tres y agregue C a los tres extremos principales de la imprimación de la guía inversa tres antes de comprar. Prueba el vector de expresión cas9 optimizado de Candida añadiendo pv1524, tampón 10x, bs9b1 y agua a 50 micro litros en un tubo de 1,5 mililitros e incubar a 55 grados Centígrados durante 20 minutos.
Enfríe la mezcla de digestión a temperatura ambiente y gire durante 30 segundos a 2348 veces G para llevar la condensación a la parte inferior del tubo. Para tratar la fosfatasa la columna vertebral digerida, añadir un microlitro de fosfatasa intestinal de ternera a la mezcla de digestión. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante una hora antes.
Ahora, el fosforilato y la guía recocida hacia adelante impriman tres y la imprimación de guía inversa tres, combinándolas con 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase, y agua en un tubo PCR. Agregue 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase y Molecular Biology Grade Water a un segundo tubo PCR como control negativo. Incubar las mezclas de reacción en un termociclo a 37 grados centígrados durante 30 minutos, luego a 95 grados centígrados durante 5 minutos.
Enfríe la mezcla a la velocidad de rampa más lenta a 16 grados Celsius para anular los oligos. A continuación, incubar la mezcla de oligococido recocido a 4 grados centígrados. Ahora ligar los oligos recocidos en PV1524 digerido.
En el primer tubo PCR, agregue 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, mezcla de oligo recocido, plásmido purificado tratado con CIP digerido y agua a un volumen total de 10 microlitros. Del mismo modo, prepare un segundo tubo pcR utilizando la mezcla de control negativo en lugar de la mezcla de oligo recocido. Incubar ambos tubos en un Termociclo a 16 grados Celsius durante 30 minutos, luego a 65 grados Celsius durante 10 minutos, y finalmente enfriar a 25 grados Celsius.
Después de la ligadura, transformar las mezclas de ligadura en células químicamente competentes y luego purificar y secuenciar los plásmidos como se describe en el protocolo de texto. Para diseñar la plantilla de reparación, inserte un codón de parada haciendo clic izquierdo en la secuencia génica y agregando nucleótidos que codifican un codón de parada y un sitio de digestión de restricción. Haga clic izquierdo en 10 bases aguas abajo de donde se realizará la mutación y arrastre el cursor 60 bases aguas arriba.
Haga clic izquierdo en la pestaña de imprimación para agregar la imprimación. Esto agregará la plantilla de reparación hacia adelante tres. A continuación, haga clic izquierdo en 10 bases aguas arriba de donde se hará la mutación y arrastre el cursor 60 bases aguas abajo.
Haga clic izquierdo en la pestaña de imprimación para agregar la imprimación. Esto agregará la plantilla de reparación invertir tres. Para generar la plantilla de reparación, agregue la imprimación de reparación hacia adelante, la imprimación inversa de la plantilla de reparación, los trifosfatos de desoxinucleótidos, el tampón, la polimerasa TACH y el agua a cada uno de los cuatro tubos PCR.
Ahora realice la extensión de imprimación ejecutando entre 20 y 30 rondas de PCR. Para digerir los plásmidos clones correctamente, agregue plásmido, 10x Buffer, Bovine Serum Albumin, KPN 1, SAC 1 y agua a 40 microlitros de volumen total en un tubo de 1,5 mililitros. Incubar a 37 grados centígrados durante la noche.
Mientras tanto, crecer un cultivo nocturno de C.albicans SC5314, prototroph de tipo salvaje, a 25 grados Celsius en uridina suplementado YPD. Haga crecer el cultivo a una densidad óptica a 600 nanómetros o OD 600 de menos de seis. Pellet cinco OD 600 unidades de células por transformación girando durante cinco minutos a 2348 veces G.Then suspender las células peletadas en 100 microlitros de TE/Acetato de litio.
Ahora, a un tubo de 1,5 mililitros y en orden, agregue las células re-suspendidas, el ADN de espermatozoides de salmón hervido y enfriado rápido, la digestión plasmática, la plantilla de reparación purificada y el tampón de la placa. Preparar un control negativo de la misma manera, excepto para sustituir el agua en un volumen igual al del ADN transformador. Después de incubar las transformaciones durante la noche, calienta las células colocándolas en un baño de agua Celsius de 44 grados durante 25 minutos.
Gire durante cinco minutos a 2348 veces G en una centrífuga de sobremesa y retire el sobrenadante de la mezcla de placas. Lavar una vez añadiendo un mililitro de uridina suplementada YPD y centrífuga de nuevo. Después de suspender las células en 0,1 mililitro de uridina suplementada YPD, incubar la suspensión en un tambor de rodillo o agitador a 25 grados Celsius durante la noche.
Al día siguiente, placa las células de Uridina Suplementado YPD con 200 microgramos por mililitro de nourseothricin. Las colonias aparecerán en dos a cinco días y deben ser rayadas para colonias individuales como se describe en el protocolo de texto. Para realizar la PCR de colonia, diseñe una imprimación de comprobación directa de aproximadamente 200 pares base hacia arriba del sitio de restricción que se introdujo, así como una imprimación inversa de aproximadamente 300 pares base aguas abajo.
Añadir 0,3 microlitros de imprimación de control directo, 0,3 microlitros de imprimación de control inverso, 0,3 microlitros de polimerasa termoestable, tres microlitros de dNTP, tres microlitros de tampón XTAC y 23 microlitros de agua a un tubo. A continuación, agregue 0,25 microlitros de una sola colonia de levadura a la mezcla utilizando una punta de pipeta P10 y teniendo cuidado de no molestar al ager. Después de amplificar el ADN por PCR, ejecute cinco microlitros de la PCR en el gel para asegurar que la amplificación sea exitosa, teniendo cuidado de no molestar el pellet de desecho celular en la parte inferior del tubo.
Los resultados representativos de la edición del genoma mediado por CRISPR en C.Albicans se muestran aquí. C.Albicans se transformó con ARN guía y plantillas de reparación destinadas a C.Albicans TPK2. Un sitio de digestión de restricción EcoR1 y los codones de parada en la plantilla de reparación interrumpen el sitio de PAM y facilitan la detección de mutantes correctos.
LA PCR de colonia seguida de la digestión de restricción distingue rápidamente el tipo salvaje de las secuencias editadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar para saber si hay varias copias de los ARN de la guía clonados en PV1524. Como esto reducirá la eficiencia de edición del genoma.
No olvide que C.Albicans es un patógeno BL2, y siempre cuando sea apropiado el atuendo de laboratorio y siga todos los procedimientos de seguridad durante la realización de este procedimiento.
