Diese Methode kann helfen, die Unterschiede zwischen Pilzen und Säugetieren auf molekularer Ebene aufzudecken. Solche Unterschiede können genutzt werden, um neue therapeutische Ansätze zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das Genom von C.Albicans effizienter verändert als klassische homologe Rekombinationstechniken.
Um die RNA-Folge zu identifizieren, identifizieren Sie eine NGG-PAM-Sequenz in der Nähe des Ortes, an dem das Stop-Codon eingesetzt wird. Hier sind alle PAM-Sequenzen in den ersten 100 Basenpaaren von TPK2, einer zyklischen AMP-Kinase-Katalytik-Untereinheit, zu finden. Identifizieren Sie die Vorwärtsführungsgrundierung drei Sequenz.
Diese Sequenz besteht aus 20 Basen direkt vor einer NGG PAM-Site und enthält nicht mehr als fünf T es in einer Reihe. Klicken Sie mit der linken Maustaste direkt vor der NGG auf die Basis und ziehen Sie den Cursor 20 Basen. Klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf die Primer-Registerkarte, um den Primer hinzuzufügen.
Identifizieren Sie nun die Reverse-Guide-Primer drei Sequenz, die das Kompliment an die Vorwärts-Guide-Sequenz sein wird. Links lecken Sie auf der Basis direkt vor der NGG und ziehen Sie den Cursor 20 Basen. Klicken Sie für jeden Primer mit der linken Maustaste auf die Registerkarte Primer, um den Primer hinzuzufügen.
Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Primer, und wählen Sie Kopiergrundierungsdaten aus. Fügen Sie die Sequenzen in ein Textbearbeitungsprogramm ein. Fügen Sie Überhangsequenzen zu Vorwärts- und Reverse-Guide-Oligos hinzu, um das Klonen zu erleichtern.
Fügen Sie die Nukleotidsequenz ATTTG an das fünf primende Ende der Vorwärtsführungsgrundierung drei und fügen Sie G zum drei Primonende der Vorwärtsführungsgrundierung drei hinzu. Schließlich, an der Nukleotid-Sequenz AAAAC an das fünf Primat des Reverse-Guide-Primurdrei und fügen Sie C an das drei Primat ende der Reverse-Guide-Primur drei vor dem Kauf. Dye testen den Candida-optimierten cas9-Expressionsvektor, indem sie pv1524, 10x Puffer, bs9b1 und Wasser zu 50 Mikrolitern in einem 1,5-Milliliter-Rohr hinzufügen und bei 55 Grad Celsius 20 Minuten lang brüten.
Kühlen Sie die Verdauungsmischung auf Raumtemperatur und drehen Sie sie 30 Sekunden bei 2348 mal G, um Kondensation auf den Boden des Rohres zu bringen. Um das verdaute Rückgrat zu behandeln, fügen Sie der Verdauungsmischung einen Mikroliter Kalbs-Darmphosphatase hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für eine Stunde zuvor.
Jetzt, Phosphorylat und Anneal-Vorwärts-Führungsgrundierung drei und Reverse-Guide-Primer drei, durch die Kombination mit 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynukleotide Kinase, und Wasser in einem PCR-Rohr. Fügen Sie 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynukleotide Kinase und Molecular Biology Grade Water zu einem zweiten PCR-Rohr als Negativkontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionsgemische in einem Thermocycler bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, dann bei 95 Grad Celsius für 5 Minuten.
Kühlen Sie die Mischung bei der langsamsten Rampenrate auf 16 Grad Celsius, um die Oligos anzuglühen. Dann die geglühte Oligomischung bei 4 Grad Celsius inkubieren. Nun ligate die geglühten Oligos in verdaute PV1524.
In der ersten PCR-Röhre, fügen Sie 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, geglüht Oligo-Mix, verdaut CIP-behandelt gereinigtes Plasmid, und Wasser zu einem 10 Mikroliter Gesamtvolumen. In ähnlicher Weise bereiten Sie eine zweite PCR-Röhre mit der negativen Kontrollmischung anstelle der geglühten Oligo-Mischung. Inkubieren Sie beide Rohre in einem Thermocycler bei 16 Grad Celsius für 30 Minuten, dann bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten und schließlich auf 25 Grad Celsius abkühlen.
Nach der Ligation die Ligationsgemische in chemisch kompetente Zellen umwandeln und dann die Plasmide, wie im Textprotokoll beschrieben, reinigen und sequenzieren. Um die Reparaturvorlage zu entwerfen, fügen Sie ein Stop-Codon ein, indem Sie mit der linken Maustaste in die Gensequenz klicken und Nukleotide hinzufügen, die eine Stop-Codon- und Restriktions-Gärungsstelle kodieren. Klicken Sie mit der linken Maustaste auf 10 Basen flussabwärts, wo die Mutation vorgenommen wird, und ziehen Sie den Cursor 60 Basen nach oben.
Links lecken Sie auf der Primer-Registerkarte, um die Grundierung hinzuzufügen. Dadurch wird die Reparaturvorlage drei vorwärts hinzugefügt. Klicken Sie dann mit der linken Maustaste auf 10 Basen vor der Stelle, an der die Mutation vorgenommen wird, und ziehen Sie den Cursor 60 Basen flussabwärts.
Klicken Sie mit der linken Maustaste auf die Primer-Registerkarte, um den Primer hinzuzufügen. Dadurch wird die Reparaturvorlage reverse three hinzugefügt. Um die Reparaturvorlage zu generieren, fügen Sie Reparaturschablonen, Reparaturvorlagen-Reverseprimer, Desoxynukleotidtriphosphate, Puffer, TACH-Polymerase und Wasser zu jedem der vier PCR-Röhren hinzu.
Führen Sie jetzt Primer-Erweiterung durch Ausführen zwischen 20 und 30 Runden PCR. Um die korrekt geklonten Plasmide zu verdauen, fügen Sie Plasmid, 10x Buffer, Bovine Serum Albumin, KPN 1, SAC 1 und Wasser zu 40 Mikroliter Gesamtvolumen in einer 1,5 Milliliter Tube hinzu. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius über Nacht.
In der Zwischenzeit wachsen eine Nachtkultur von C.albicans SC5314, Wildtyp-Prototroph, bei 25 Grad Celsius in Uridin ergänzt YPD. Wachsen Sie die Kultur auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 von weniger als sechs. Pellet fünf OD 600 Einheiten von Zellen pro Transformation durch Spinnen für fünf Minuten bei 2348 mal G.Dann suspendieren die Pelletzellen in 100 Mikroliter TE/Lithium Acetat.
Nun, zu einem 1,5 Milliliter-Röhrchen und in Ordnung, fügen Sie die wieder suspendierten Zellen, gekochte und schnell gekühlte Lachs Spermien DNA, die Plasma-Verdauung, die gereinigte Reparatur-Vorlage, und Plattenpuffer. Bereiten Sie eine negative Kontrolle auf die gleiche Weise vor, außer Wasser in einem Volumen zu ersetzen, das dem der transformierenden DNA entspricht. Nachdem Sie die Transformationen über Nacht inkubiert haben, wärmen Sie die Zellen, indem Sie sie 25 Minuten lang in ein 44 Grad Celsius Wasserbad legen.
Drehen Sie für fünf Minuten bei 2348 mal G in einer Bank oben Zentrifuge und entfernen Sie die Plattenmischung Überstand. Waschen Sie einmal durch Zugabe eines Milliliters Uridin Ergänzt YPD und Zentrifuge wieder. Nach dem Aussetzen der Zellen in 0,1 Milliliter Uridin Ergänzt YPD, inkubieren Sie die Suspension auf einer Walzentrommel oder Shaker bei 25 Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag, Platte die Zellen auf Uridin Ergänzt yPD mit 200 Mikrogramm pro Milliliter Nourseothricin. Kolonien werden in zwei bis fünf Tagen erscheinen und sollten für einzelne Kolonien gestreift werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Um Kolonie-PCR durchzuführen, entwerfen Sie eine Vorwärts-Check-Primer über 200 Base-Paare bis Strom der Einschränkung Seerstelle, die eingeführt wurde, sowie eine umgekehrte Grundierung etwa 300 Basenpaare nachgeschaltet.
Fügen Sie 0,3 Mikroliter Vorwärts-Check-Primer, 0,3 Mikroliter Reverse-Check-Primer, 0,3 Mikroliter thermostabile Polymerase, drei Mikroliter dNTpes, drei Mikroliter XTAC-Puffer und 23 Mikroliter Wasser in ein Rohr. Dann fügen Sie 0,25 Mikroliter einer einzelnen Hefekolonie in die Mischung mit einer P10 Pipettenspitze und achten darauf, die Ager nicht zu stören. Nach der Verstärkung der DNA durch PCR, führen Sie fünf Mikroliter der PCR auf dem Gel, um sicherzustellen, dass die Amplifikation erfolgreich ist, wobei darauf zu achten ist, dass das Zellabfallpellet am Boden des Rohres nicht gestört wird.
Repräsentative Ergebnisse für die VON CRISPR vermittelte Genombearbeitung in C.Albicans werden hier gezeigt. C.Albicans wurde mit Guide RNAs und Reparaturvorlagen transformiert, die auf C.Albicans TPK2 abzielen. Eine EcoR1-Einschränkungs-Gärungsstelle und Stopp-Codons in der Reparaturvorlage stören die PAM-Site und erleichtern das Screening auf korrekte Mutanten.
Colony PCR gefolgt von Einschränkung Verdauung unterscheidet wild Typ schnell von bearbeiteten Sequenzen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, nach mehreren Kopien der in PV1524 geklonten Führungs-RNAs zu suchen. Da dies die Genom-Editing-Effizienz verringert.
Vergessen Sie nicht, C.Albicans ist ein BL2-Erreger, und immer wo angemessen Laborkleidung und folgen Sie allen Sicherheitsverfahren während der Durchführung dieses Verfahrens.
