Bu yöntem mantarlar ve memeliler arasındaki farkları moleküler düzeyde ortaya yardımcı olabilir. Bu tür farklılıklar yeni tedavi yaklaşımlarını belirlemek için kaldıraçlı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, C.Albicans'ın genomunu klasik homolog rekombinasyon tekniklerinden daha verimli bir şekilde modibiye olmasıdır.
Kılavuz RNA dizisini tanımlamak için, durdurma kodonunun eklendiği yere yakın bir NGG PAM dizisi tanımlayın. Burada gösterilen, tüm PAM dizileri TPK2, döngüsel AMP kiyaz katalitik alt birim ilk 100 baz çiftleri bulunur. İleri kılavuz astar üç sırasını tanımlayın.
Bu sıra, bir NGG PAM sitesinin doğrudan yukarısında 20 baz olacaktır ve üst üste beş T'den fazla t içermez. NGG'nin yukarısına doğrudan tabanına tıklayın ve imleci 20 tabanı sürükleyin. Ardından, astar eklemek için astar sekmesine sol tıklayın.
Şimdi, ters kılavuz astar ı üç sırasını tanımlayın, bu da ileri kılavuz dizisinin iltifatı olacaktır. NGG'nin yukarısına doğru tabanında sol yalamak ve imleç 20 üsleri sürükleyin. Her astar için, astar eklemek için astar sekmesine sol tıklayın.
Astarı sağ tıklatın ve kopya astar verilerini seçin. Dizileri bir metin düzenleme programına yapıştırın. Klonlamayı kolaylaştırmak için ileri ve geri kılavuz oligolarına çıkıntı dizileri ekleyin.
İleri kılavuz astar üç beş asal ucuna nükleotit dizisi ATTTG ekleyin ve ileri kılavuz astar üç üç asal ucuna G ekleyin. Son olarak, nükleotid dizisi AAAAC ters kılavuz astar üç beş asal ucuna ve satın almadan önce ters kılavuz astar üç üç asal ucuna C ekleyin. Boya test Candida pv1524 ekleyerek cas9 ifade vektörü optimize, 10x tampon, bs9b1, ve su 50 mikro litre bir 1.5 mililitre tüp ve 20 dakika boyunca 55 derece santigrat de kuluçka.
Tüpün dibine yoğuşma getirmek için sindirim karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun ve 2348 g'de 30 saniye döndürün. Fosfataz sindirilmiş omurga tedavi etmek için, sindirim karışımı buzağı bağırsak fosfataz bir mikrolitre ekleyin. Reaksiyonu 37 derecede bir saat önce kuluçkaya yatırın.
Şimdi, fosforilat ve anneal ileri kılavuzu astar üç ve ters kılavuz astar üç, 10x T4 Ligase Tampon ile birleştirerek, T4 Polinükleotid Kinasi, ve pcr tüp su. Negatif kontrol olarak ikinci bir PCR tüpüne 10x T4 Ligase Tampon, T4 Polinükleotid Kinazve Moleküler Biyoloji Sınıf Su ekleyin. Reaksiyon karışımlarını 37 derecede 37 derecede, sonra 95 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın.
Oligoları tavlamak için karışımı en yavaş rampa hızında 16 santigrat dereceye kadar soğutun. Sonra 4 santigrat derece anneli oligo karışımı kuluçka. Şimdi sindirilmiş PV1524 içine annelik oligos ligate.
İlk PCR tüpünde, 10x T4 Ligase Tampon, t4 DNA Ligase, annealed oligo karışımı, sindirilmiş CIP ile arıtılmış plazmid ve 10 mikrolitre toplam hacimsu su ekleyin. Benzer şekilde annealed oligo karışımı yerine negatif kontrol karışımı kullanarak ikinci bir PCR tüp hazırlamak. Termocycler'da her iki tüpü de 16 derecede 30 dakika, sonra 65 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın ve son olarak 25 santigrat dereceye kadar soğutun.
Ligasyondan sonra, ligasyon karışımlarını kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün ve metin protokolünde açıklandığı gibi plazmidleri arındırın ve sıralayın. Onarım şablonu tasarlamak için, gen dizisinde sol atıklama ve bir stop kodonu ve kısıtlama sindirim sitesi kodlayan nükleotitler ekleyerek bir stop kodonu ekleyin. Mutasyonun yapılacağı yerin aşağısındaki 10 baza tıklayın ve imleci 60 tabanı yukarı sürükleyin.
Astar eklemek için astar sekmesinde sol yalamak. Bu, onarım şablonu ileri üç ekler. Daha sonra mutasyonun yapılacağı yerin yukarısındaki 10 baza tıklayın ve imleci 60 tabanı aşağı sürükleyin.
Astar eklemek için astar sekmesine sol tıklayın. Bu onarım şablonu ters üç ekler. Onarım şablonu oluşturmak için, onarım şablonu ileri astar, onarım şablonu ters astar, deoksinükleotid trifosfatlar, tampon, TACH polimeraz ve su her dört PCR tüpleri ekleyin.
Şimdi PCR 20 ve 30 tur arasında çalıştırarak astar uzantısı gerçekleştirin. Doğru klonlanmış plazmidleri sindirmek için, plazmid, 10x Tampon, Sığır Serum Albumin, KPN 1, SAC 1 ve 1,5 mililitrelik bir tüpte 40 mikrolitre lik toplam hacime su ekleyin. Bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yat.
Bu arada, C.albicans SC5314, yabani tip prototroph bir gecede kültür büyümek, uridine takviye Lidin 25 santigrat derece. 600 nanometre veya OD 600 az altı bir optik yoğunluğu için kültür büyümek. Pelet 2348 kez G.Then TE / Lityum Asetat 100 mikrolitre pelethücreleri askıya beş dakika eğerek dönüşüm başına hücre 5 OD 600 birim.
Şimdi, bir 1.5 mililitretüp ve sırayla, yeniden askıya hücreleri, haşlanmış ve hızlı soğutulmuş somon sperm DNA, plazma sindirim, saf onarım şablonu ve plaka tampon ekleyin. Dönüştüren DNA'ya eşit bir hacimde su yerine su yerine dışında, aynı şekilde negatif bir kontrol hazırlayın. Dönüşümleri bir gecede kuluçkaya yatırdıktan sonra, ısı 25 dakika boyunca 44 derece santigrat derece su banyosuna koyarak hücreleri fırlatır.
Bir tezgah üst santrifüj 2348 kez G beş dakika spin ve plaka karışımı supernatant kaldırın. Bir mililitre Uridine Takviye YPD ve santrifüj ekleyerek bir kez yıkayın. Uridine Takviye YPD 0.1 mililitre hücreleri askıya sonra, bir gecede 25 derece santigrat bir rulo davul veya shaker süspansiyon kuluçka.
Ertesi gün, plaka Uridine üzerinde ypd üzerinde hücreler ile 200 nourseothricin mililitre başına mikrogram. Koloniler iki ila beş gün içinde görünür ve metin protokolünde açıklandığı gibi tek koloniler için çizgili olmalıdır. Koloni PCR gerçekleştirmek için, tanıtılan kısıtlama alanının akışıkadar yaklaşık 200 baz çifti ve yaklaşık 300 baz çifti aşağı bir ters astar tasarımı.
0,3 mikrolitre ileri kontrol astarı, 0,3 mikrolitre ters kontrol astarı, 0,3 mikrolitre termokararlı polimeraz, üç mikrolitre dNTP, üç mikrolitre XTAC tamponve bir tüpe 23 mikrolitre su ekleyin. Daha sonra p10 pipet ucu kullanarak karışıma tek bir maya kolonisinin 0,25 mikrolitre ekleyin ve ager rahatsız değil dikkat. PCR ile DNA'yı yükselttikten sonra, amplifikasyonun başarılı olmasını sağlamak için jel üzerinde beş mikrolitre PCR çalıştırın ve tüpün altındaki hücre enkaz peletini rahatsız etmemeye özen gösteriyor.
C.Albicans'da CRISPR aracılı genom düzenlemeiçin temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. C.Albicans, C.Albicans TPK2'yi hedefleyen kılavuz RNA'lar ve onarım şablonları ile dönüştürüldü. Bir EcoR1 kısıtlama sindirim sitesi ve onarım şablonundaki kodonları durdurmak PAM sitesini bozar ve doğru mutantlar için taramayı kolaylaştırır.
Kısıtlama sindiriminin ardından gelen Colony PCR, yabani tipi düzenlenmiş dizilerden hızla ayırır. Bu yordamı denerken, PV1524'e klonlanmış kılavuz RNA'larının birden çok kopyasını denetlemeyi unutmamak önemlidir. Bu genom düzenleme verimliliğini düşürecek gibi.
Unutmayın, C.Albicans bir BL2 patojen, ve her zaman nerede uygun laboratuvar kıyafetleri ve bu işlemi yaparken tüm güvenlik prosedürleri izleyin.
