שיטה זו יכולה לעזור לחשוף את ההבדלים בין פטריות ליונקים ברמה המולקולרית. הבדלים כאלה יכולים להיות ממונפים כדי לזהות גישות טיפוליות חדשות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משנה ביעילות רבה יותר את הגנום של C.Albicans מאשר טכניקות רקומבינציה הומולוגיות קלאסיות.
כדי לזהות את רצף ה- RNA של המדריך, זהה רצף NGG PAM קרוב למקום שבו יתווסף קודון העצור. מוצגים כאן, הם כל רצפי PAM נמצאו 100 זוגות הבסיס הראשונים של TPK2, מחזורי AMP kinase קטליטית. זהה את הרצף של פריימר 3 של המדריך קדימה.
רצף זה יהיה 20 בסיסים ישירות במעלה הזרם של אתר NGG PAM ולא יכיל יותר מחמישה T של ברציפות. שמאל לחץ על הבסיס ישירות במעלה הזרם של NGG וגרור את הסמן 20 בסיסים. לאחר מכן, לחץ שמאלה על הכרטיסיה פריימר כדי להוסיף את פריימר.
עכשיו, לזהות את המדריך ההפוך פריימר שלושה רצף, אשר יהיה המחמאה לרצף המדריך קדימה. שמאל ללקק על הבסיס ישירות במעלה הזרם של NGG ולגרור את הסמן 20 בסיסים. עבור כל פריימר, לחץ שמאלה על הכרטיסיה פריימר כדי להוסיף את פריימר.
לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על פריימר ובחר העתק נתוני פריימר. הדבק את הרצפים בתוכנית לעריכת טקסט. הוסף רצפי overhang כדי קדימה ולהפוך מדריך אוליגוס כדי להקל על שיבוט.
הוסף את רצף הנוקלאוטייד ATTTG לקצה החמישי של פריימר המדריך הקדמי שלוש והוסף G לקצה השלישי של פריימר מדריך קדימה שלוש. לבסוף, ברצף הנוקלאוטיד AAAAC עד לקצה החמישי של פריימר המדריך ההפוך שלוש ולהוסיף C לקצה השלישי של פריימר המדריך ההפוך שלוש לפני הרכישה. בדיקת צבע וקטור ביטוי cas9 אופטימיזציה קנדידה על ידי הוספת pv1524, חיץ 10x, bs9b1, ומים ל 50 מיקרו ליטר בצינור 1.5 מיליליטר ודגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
מקררים את תערובת העיכול לטמפרטורת החדר ומסתובבים במשך 30 שניות ב 2348 פעמים G כדי להביא עיבוי לתחתית הצינור. כדי פוספטאז לטפל עמוד השדרה מתעכל, להוסיף מיקרוליטר אחד של פוספטאז מעי עגל לתערובת העיכול. דגירה התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת לפני.
עכשיו, זרחן ו- anneal קדימה מדריך פריימר שלוש ו המדריך ההפוך פריימר שלוש, על ידי שילוב אותם עם חיץ 10x T4 Ligase, T4 Polynucleotide Kinase, ומים בצינור PCR. הוסף חיץ ליגאז T4 10x, T4 פולינוקלאוטיד קינאז, ומים כיתה ביולוגיה מולקולרית לצינור PCR השני כפקד שלילי. הדגירה את תערובות התגובה בתרמוצ'יקלר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
מקררים את התערובת בקצב הרמפה האיטי ביותר ל-16 מעלות צלזיוס כדי להפוך את האוליגוס לאנוי. ואז להחריג את תערובת אוליגו annealed ב 4 מעלות צלזיוס. עכשיו ליגטה אוליגוס annealed לתוך מתעכל PV1524.
בצינור PCR הראשון, להוסיף 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, תערובת אוליגו annealed, פלסמיד מטוהרים שטופלו CIP מתעכל, ומים לנפח כולל 10 מיקרוליטר. באופן דומה להכין צינור PCR השני באמצעות תערובת שליטה שלילית במקום תערובת אוליגו annealed. דגירה שני הצינורות ב Thermocycler ב 16 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולבסוף להתקרר ל 25 מעלות צלזיוס.
לאחר הרצועה, להפוך את תערובות הקשירה לתאים מוכשרים מבחינה כימית ולאחר מכן לטהר ולרצף את הפלסמידים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לעצב את תבנית התיקון, הכנס קודון עצירה על-ידי לחיצה שמאלית ברצף הגנים והוספת נוקלאוטידים המקודדים אתר עצירת קודון ועיכול הגבלה. שמאל לחץ על 10 בסיסים במורד הזרם שבו המוטציה תהפוך ולגרור את הסמן 60 בסיסים במעלה הזרם.
ללקק שמאלה בכרטיסיה פריימר כדי להוסיף את פריימר. פעולה זו תוסיף את תבנית התיקון קדימה שלוש. לאחר מכן שמאלה לחץ 10 בסיסים במעלה הזרם שבו המוטציה תהפוך ולגרור את הסמן 60 בסיסים במורד הזרם.
שמאל לחץ על הכרטיסייה פריימר כדי להוסיף את פריימר. פעולה זו תוסיף את תבנית התיקון הפוכה שלוש. כדי ליצור את תבנית התיקון, הוסף פריימר העברת תבנית תיקון, תיקון פריימר הפוך תבנית, deoxynucleotide טריפוספטים, מאגר, פולימראז TACH, ומים לכל אחד מארבעת צינורות PCR.
כעת בצע הארכת פריימר על-ידי הפעלה בין 20 ל- 30 סיבובים של PCR. כדי לעכל את הפלסמידים המשוכפלים כראוי, הוסף פלסמיד, חיץ 10x, אלבומין סרום Bovine, KPN 1, SAC 1 ומים לנפח כולל של 40 מיקרוליטר בצינור מיליליטר 1.5 מיליליטר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
בינתיים, לגדל תרבות לילה של C.albicans SC5314, פרוטוטרופיה מסוג פראי, ב 25 מעלות צלזיוס ב uridine בתוספת YPD. הגדל את התרבות לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר או OD 600 של פחות משש. גלולה חמש יחידות OD 600 של תאים לכל המרה על ידי ספינינג במשך חמש דקות ב 2348 פעמים G.Then להשעות את התאים גלולה ב 100 microliters של TE / ליתיום אצטט.
עכשיו, לצינור 1.5 מיליליטר ובסדר, מוסיפים את התאים המושעים מחדש, דנ"א זרע סלמון מבושל וקירור מהיר, עיכול הפלזמה, תבנית התיקון המטוהרת ומאגר הלוחות. הכינו שליטה שלילית באותו אופן, למעט החלפת מים בנפח השווה לזה של הדנ"א ההופך. לאחר הדגירה של התמורות בן לילה, מחממים את התאים על ידי הנחתם באמבט מים של 44 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.
לסובב במשך חמש דקות ב 2348 פעמים G בצנטריפוגה העליון ספסל ולהסיר את תערובת הצלחת על טבעי. לשטוף פעם אחת על ידי הוספת מיליליטר אחד של Uridine בתוספת YPD וצנטריפוגה שוב. לאחר השעיית התאים ב 0.1 מיליליטר של Uridine בתוספת YPD, דגירה ההשעיה על תוף רולר או שייקר ב 25 מעלות צלזיוס לילה.
למחרת, צלחת התאים על Uridine בתוספת YPD עם 200 מיקרוגרם למיליליטר של nourseothricin. מושבות יופיעו בעוד יומיים עד חמישה ימים ויש לפסים עבור מושבות בודדות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע PCR מושבה, לתכנן פריימר לבדוק קדימה על 200 זוגות בסיס במעלה הזרם של אתר ההגבלה שהוצג, כמו גם פריימר הפוך כ 300 זוגות בסיס במורד הזרם.
הוסף 0.3 מיקרוליטרים של פריימר הסימון קדימה, 0.3 מיקרוליטרים של פריימר הסימון ההפוך, 0.3 מיקרוליטרים של פולימראז הניתן לעצירה, שלושה מיקרוליטרים של dNTP, שלושה מיקרוליטרים של חיץ XTAC, ו 23 microliters של מים לצינור. לאחר מכן מוסיפים 0.25 מיקרוליטרים של מושבת שמרים אחת לתערובת באמצעות קצה פיפטה P10 ומדאגים לא להפריע לאגר. לאחר הגברת ה-DNA על ידי PCR, להפעיל חמישה microliters של PCR על הג'ל כדי להבטיח הגברה מוצלחת, דואג לא להפריע גלולת פסולת התא בתחתית הצינור.
תוצאות מייצגות לעריכת גנום מתווך CRISPR ב C.Albicans מוצגים כאן. C.Albicans השתנה עם RNAs מדריך ותבניות תיקון כי היעד C.Albicans TPK2. אתר עיכול הגבלת EcoR1 ולעצור קודונים בתבנית התיקון לשבש את אתר PAM להקל על ההקרנה עבור מוטנטים נכונים.
מושבה PCR ואחריו עיכול הגבלה במהירות מבדיל סוג פראי רצפים ערוכים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחפש עותקים מרובים של RNAs המדריך משוכפל לתוך PV1524. מכיוון שזה יוריד את יעילות עריכת הגנום.
אל תשכח, C.Albicans הוא פתוגן BL2, ותמיד איפה הלבוש במעבדה המתאים בצע את כל נהלי הבטיחות בעת ביצוע הליך זה.
