이 방법은 분자 수준에서 곰팡이와 포유동물의 차이를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 차이는 새로운 치료 접근 방식을 식별하기 위해 활용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고전적인 상동성 재조합 기술보다 C.Albicans의 게놈을 보다 효율적으로 수정한다는 것입니다.
가이드 RNA 서열을 식별하기 위해 정지 코돈이 삽입되는 위치에 가까운 NGG PAM 서열을 식별한다. 여기에 도시된 모든 PAM 서열은 TPK2의 첫 번째 100베이스 쌍, 순환 AMP 키나아제 촉매 서브유닛에서 발견되는 모든 PAM 서열이다. 전방 가이드 프라이머 3개의 시퀀스를 식별합니다.
이 시퀀스는 NGG PAM 사이트의 상류에 있는 20개의 기지가 될 것이며 5개 이상의 T를 연속으로 포함하지 않습니다. NGG의 바로 상류의 베이스를 클릭하고 커서 20 베이스를 드래그합니다. 그런 다음 프라이머 탭을 클릭하여 프라이머를 추가합니다.
이제 역방향 안내서 프라이머 3개의 시퀀스를 식별하여 앞으로 가이드 시퀀스에 대한 칭찬이 됩니다. NGG의 바로 상류에 있는 베이스에 핥고 커서 20베이스를 드래그합니다. 각 프라이머에 대해 프라이머 탭을 클릭하여 프라이머를 추가합니다.
프라이머를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사 프라이머 데이터를 선택합니다. 시퀀스를 텍스트 편집 프로그램에 붙여 넣습니다. 오버행 시퀀스를 추가하여 앞으로 및 역방향 가이드 올리고스를 추가하여 복제를 용이하게 합니다.
뉴클레오티드 서열 ATTTG를 전방 가이드 프라이머 3의 5개의 프라임 엔드에 추가하고 3개의 전방 가이드 프라이머프라이머의 3개의 프라임 엔드에 G를 추가한다. 마지막으로, 뉴클레오티드 서열에서 AAAAC는 역가이드 프라이머 3의 5개의 프라임 엔드로 구매하기 전에 역가이드 프라이머 3의 3개의 프라임 엔드에 C를 첨가한다. 염료는 1.5 밀리리터 튜브에 pv1524, 10x 버퍼, bs9b1 및 물을 50 마이크로 리터에 추가하여 칸디다 최적화 된 cas9 발현 벡터를 테스트하고 20 분 동안 섭씨 55도에서 배양합니다.
소화 혼합물을 실온으로 식히고 2348회 G에서 30초 간 회전하여 튜브 바닥에 응축을 가져옵니다. 인산염을 소화된 백본을 치료하려면, 종아리 장내 인산염 1마이크로리터를 소화 혼합물에 추가합니다. 1시간 전에 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다.
지금, 인광 및 멸폐 앞으로 가이드 프라이머 3 및 역 가이드 프라이머 3, 10 x T4 리간제 버퍼와 결합 하 여, T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제, 그리고 PCR 튜브에 물. 10x T4 리개아제 버퍼, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 분자 생물학 등급 물을 두 번째 PCR 튜브에 음의 대조군으로 추가합니다. 온도 순환기에서 30분 동안 37도, 섭씨 95도에서 5분간 반응 혼합물을 배양합니다.
가장 느린 경사로 속도로 혼합물을 냉각하여 섭씨 16도까지 냉각하여 올리고를 음침합니다. 그런 다음 안구 된 올리고 혼합물을 섭씨 4도에서 배양합니다. 이제 아닐링 된 올리고를 소화 된 PV1524로 리디플합니다.
첫 번째 PCR 튜브에서는 10x T4 Ligase 버퍼, t4 DNA 리간세, 아닐드 올리고 믹스, 소화된 CIP 처리 정제 플라스미드, 물을 10 마이크로리터 총 부피에 추가합니다. 마찬가지로 아닐리고 혼합물 대신 음의 제어 혼합물을 사용하여 제2 PCR 튜브를 준비한다. 온도 16도에서 온도 16도에서 두 튜브를 30분 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 10분 간 식히고 마침내 섭씨 25도까지 식힙니다.
결찰다음, 결찰 혼합물을 화학적으로 유능한 세포로 변환한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 정화하고 시퀀스합니다. 수리 템플릿을 설계하려면, 유전자 서열을 클릭하고 정지 코돈 및 제한 소화 부위를 인코딩하는 뉴클레오티드를 추가하여 스톱 코동을 삽입한다. 왼쪽 버튼 10 개의 베이스 다운스트림에서 돌연변이가 만들어질 위치를 클릭하고 커서 60 베이스를 상류로 드래그합니다.
프라이머 탭에 핥아 프라이머를 추가합니다. 이렇게 하면 수리 템플릿이 세 앞으로 추가됩니다. 그런 다음 돌연변이가 만들어지는 곳의 상류10베이스를 클릭하고 커서 60베이스를 하류로 드래그합니다.
프라이머 탭을 클릭하여 프라이머를 추가합니다. 이렇게 하면 복구 템플릿 이세 되면 됩니다. 수리 템플릿을 생성하려면 4개의 PCR 튜브 각각에 수리 템플릿 포워드 프라이머, 수리 템플릿 역프라이머, 탈옥뉴클레오티드 트리포산염, 완충, TACH 폴리머라제 및 물을 추가합니다.
이제 PCR의 20~30라운드를 실행하여 프라이머 확장을 수행합니다. 올바르게 복제된 플라스미드를 소화하려면 1.5 밀리리터 튜브에 플라스미드, 10배 버퍼, 소혈표 알부민, KPN 1, SAC 1 및 물을 40 마이크로리터에 추가합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오.
한편, C.albicans SC5314의 하룻밤 문화를 성장, 야생 형 프로토 트로프, 에서 25 소변 보충 YPD에서 섭씨. 600 나노미터 또는 6 미만의 OD 600에서 광학 밀도로 배양을 성장시다. 펠릿 5 OD 600 세포는 G.2348 시간 G.에서 5 분 동안 회전하여 변환 당 세포의 5 개 OD 600 단위.다음 TE / 리튬 아세테이트의 100 마이크로 리터에서 펠릿 세포를 일시 중단.
이제 1.5 밀리리터 튜브에 순서대로, 재부유 된 세포, 삶은 및 빠르게 냉각 된 연어 정자 DNA, 플라즈마 소화, 정제 된 수리 템플릿 및 플레이트 버퍼를 추가하십시오. 변형 DNA와 동일한 부피로 물을 대체하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 음의 대조를 준비합니다. 하룻밤 사이에 변형을 배양 한 후, 가열 25 분 동안 섭씨 44도 수조에 배치하여 세포를 척.
벤치 상단 원심분리기에서 2348회 G에서 5분간 회전하고 플레이트 혼합물 상판을 제거합니다. 우리딘 보충 YPD와 원심분리기의 1 밀리리터를 다시 추가하여 한 번 씻으십시오. Uridine 보충 YPD의 0.1 밀리리터에서 세포를 일시 중단 한 후, 하룻밤 25섭씨에서 롤러 드럼이나 셰이커에 서스펜션을 배양.
다음 날, 우리딘에 세포를 접시 보충 YPD와 200 nourseothricin의 밀리 리터 당 마이크로 그램. 식민지는 2~5일 후에 나타나며 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 식민지에 대해 줄무늬가 있어야 합니다. 콜로니 PCR을 수행하려면, 도입 된 제한 부위의 스트림까지 약 200 베이스 페어 및 역프라이머 약 300 베이스 쌍 다운스트림을 설계합니다.
전방 체크 프라이머 0.3 마이크로리터, 리버스 체크 프라이머 0.3 마이크로리터, 열안정 폴리머라제 0.3 마이크로리터, dNTP의 마이크로리터 3개, XTAC 버퍼 3개, 마이크로리터 23마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 그런 다음 P10 파이펫 팁을 사용하여 혼합물에 단일 효모 콜로니의 0.25 마이크로리터를 추가하고 애저에 방해하지 않도록 주의하십시오. PCR에 의해 DNA를 증폭한 후, 증폭이 성공적일 수 있도록 젤에 PCR의 5마이크로리터를 실행하여 튜브 바닥의 세포 파편 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
C.Albicans에서 CRISPR 중재 게놈 편집을 위한 대표적인 결과는 여기에서 표시됩니다. C.Albicans는 C.Albicans TPK2를 대상으로 하는 가이드 RNA 및 수리 템플릿으로 변형되었습니다. EcoR1 제한 소화 사이트 및 수리 템플릿에서 코돈 중지PAM 사이트를 방해하고 올바른 돌연변이에 대한 검사를 용이하게합니다.
콜로니 PCR다음에 제한 소화가 야생 유형을 편집된 시퀀스와 빠르게 구별합니다. 이 절차를 시도하는 동안 PV1524로 복제된 가이드 RNA의 여러 복사본을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 게놈 편집 효율을 낮출 수 있습니다.
잊지 마세요, C.Albicans는 BL2 병원체이며, 항상 적절한 실험실 복장과이 절차를 수행하는 동안 모든 안전 절차를 따르십시오.
