Cette méthode peut aider à révéler les différences entre les champignons et les mammifères au niveau moléculaire. De telles différences peuvent être exploitées pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle modifie plus efficacement le génome des C.Albicans que les techniques classiques de recombinaison homologue.
Pour identifier la séquence d’ARN guide, identifiez une séquence NGG PAM près de l’endroit où le codon d’arrêt sera inséré. Montré ici, sont toutes les séquences PAM trouvés dans les 100 premières paires de base de TPK2, un subunit catalytique kinase AMP cyclique. Identifiez l’amorce du guide avant trois séquences.
Cette séquence sera de 20 bases directement en amont d’un site NGG PAM et ne contiendra pas plus de cinq T d’affilée. Cliquez à gauche sur la base directement en amont du NGG et faites glisser le curseur 20 bases. Ensuite, cliquez à gauche sur l’onglet amorce pour ajouter l’amorce.
Maintenant, identifiez l’amorce de guide inverse trois séquence, qui sera le compliment à la séquence de guide vers l’avant. Gauche lécher sur la base directement en amont de la NGG et faire glisser le curseur 20 bases. Pour chaque amorce, cliquez à gauche sur l’onglet amorce pour ajouter l’amorce.
Cliquez à droite sur l’amorce et sélectionnez les données d’amorce de copie. Coller les séquences dans un programme d’édition de texte. Ajouter des séquences de surplomb pour orienter vers l’avant et inverser les oligos pour faciliter le clonage.
Ajouter la séquence nucléotide ATTTG à l’extrémité principale de cinq extrémités de l’amorce guide avant trois et ajouter G à l’extrémité trois premiers de l’amorce guide avant trois. Enfin, à la séquence nucléotide AAAAC à l’extrémité principale cinq de l’amorce guide inverse trois et ajouter C à l’extrémité trois premiers de l’amorce guide inverse trois avant l’achat. Testez le vecteur d’expression de cas9 optimisé Candida en ajoutant du pv1524, du tampon 10x, du bs9b1 et de l’eau à 50 micro litres dans un tube de 1,5 millilitre et incubez à 55 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Refroidir le mélange de digestion à température ambiante et faire tourner pendant 30 secondes à 2348 fois G pour apporter de la condensation au fond du tube. Pour traiter la phosphatase de l’épine dorsale digérée, ajouter un microlitre de phosphatase intestinale du veau au mélange de digestion. Incuber la réaction à 37 degrés Celsius pendant une heure avant.
Maintenant, phosphorylate et anneal avant guide amorce trois et inverse guide amorce trois, en les combinant avec 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase, et de l’eau dans un tube PCR. Ajoutez 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase, et Molecular Biology Grade Water à un deuxième tube PCR comme un contrôle négatif. Incuber les mélanges de réaction dans un Thermocycler à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 5 minutes.
Refroidir le mélange à la vitesse de rampe la plus lente à 16 degrés Celsius pour anneal les oligos. Puis incuber le mélange d’oligo annelé à 4 degrés Celsius. Maintenant ligate les oligos annelés en PV1524 digéré.
Dans le premier tube PCR, ajouter 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligase, mélange oligo annelé, cip-traité cip-traité plasmide purifié, et l’eau à un volume total de 10 microlitres. De même préparer un deuxième tube PCR en utilisant le mélange de contrôle négatif au lieu du mélange oligo annelé. Incuber les deux tubes dans un Thermocycler à 16 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes, et enfin refroidir à 25 degrés Celsius.
Après ligature, transformer les mélanges de ligature en cellules chimiquement compétentes, puis purifier et séquencer les plasmides tels que décrits dans le protocole de texte. Pour concevoir le modèle de réparation, insérez un codon d’arrêt en cliquant à gauche dans la séquence génétique et en ajoutant des nucléotides qui codent un codon d’arrêt et un site de digestion de restriction. Cliquez à gauche sur 10 bases en aval de l’endroit où la mutation sera effectuée et faites glisser le curseur 60 bases en amont.
Lécher à gauche sur l’onglet amorce pour ajouter l’amorce. Cela ajoutera le modèle de réparation vers l’avant trois. Puis cliquez à gauche 10 bases en amont de l’endroit où la mutation sera faite et faites glisser le curseur 60 bases en aval.
Cliquez à gauche sur l’onglet amorce pour ajouter l’amorce. Cela ajoutera le modèle de réparation inverse trois. Pour générer le modèle de réparation, ajoutez l’amorce avant de modèle de réparation, l’amorce inverse de modèle de réparation, les triphosphates de désoxynucléotide, le tampon, la polymésase de TACH, et l’eau à chacun des quatre tubes de PCR.
Effectuez maintenant l’extension d’amorce en exécutant entre 20 et 30 tours de PCR. Pour digérer les plasmides correctement clonés, ajouter le plasmide, le tampon 10x, l’albumine bovine de sérum, KPN 1, sac 1, et l’eau à 40 microlitres volume total dans un tube de 1,5 millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Pendant ce temps, cultiver une culture du jour au lendemain de C.albicans SC5314, prototrophe de type sauvage, à 25 degrés Celsius en uridine complété YPD. Développez la culture à une densité optique à 600 nanomètres ou OD 600 de moins de six. Pellet cinq OD 600 unités de cellules par transformation en tournant pendant cinq minutes à 2348 fois G.Puis suspendre les cellules granulées dans 100 microlitres de TE / Lithium Acétate.
Maintenant, à un tube de 1,5 millilitre et dans l’ordre, ajouter les cellules re-suspendues, bouilli et refroidi rapidement l’ADN du sperme de saumon, la digestion plasmatique, le modèle de réparation purifié, et tampon plaque. Préparer un contrôle négatif de la même manière, sauf pour remplacer l’eau à un volume égal à celui de l’ADN transformateur. Après avoir couver les transformations pendant la nuit, chauffer les cellules en les plaçant dans un bain d’eau de 44 degrés Celsius pendant 25 minutes.
Faire tourner pendant cinq minutes à 2348 fois G dans une centrifugeuse du dessus du banc et retirer le mélange de plaque supernatant. Lavez-le une fois en ajoutant un millilitre d’Uridine complété YPD et centrifugeuse à nouveau. Après avoir suspendu les cellules dans 0,1 millilitre d’Uridine complété YPD, incuber la suspension sur un tambour à roulettes ou shaker à 25 degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, plaquez les cellules sur Uridine complété YPD avec 200 microgrammes par millilitre de nourseothricin. Les colonies apparaîtront dans deux à cinq jours et devraient être striées pour des colonies simples comme décrit dans le protocole de texte. Pour effectuer le PCR de colonie, concevez une amorce de vérification vers l’avant d’environ 200 paires de base en amont du site de restriction qui a été introduit, ainsi qu’une amorce inverse d’environ 300 paires de base en aval.
Ajoutez 0,3 microlitres d’amorce de contrôle avant, 0,3 microlitres d’amorce de contrôle inverse, 0,3 microlitres de polymése thermostable, trois microlitres de dNTP, trois microlitres de tampon XTAC et 23 microlitres d’eau à un tube. Ajouter ensuite 0,25 microlitres d’une seule colonie de levure au mélange à l’aide d’une pointe de pipette P10 et en prenant soin de ne pas déranger l’ager. Après avoir amplifié l’ADN par PCR, exécutez cinq microlitres du PCR sur le gel pour assurer le succès de l’amplification, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de débris cellulaires au fond du tube.
Les résultats représentatifs de l’édition du génome 2018 de CRISPR dans C.Albicans sont présentés ici. C.Albicans a été transformé avec des ARN guides et des modèles de réparation qui ciblent C.Albicans TPK2. Un site de digestion de restriction EcoR1 et arrêter les codons dans le modèle de réparation perturbent le site PAM et facilitent le dépistage des mutants corrects.
Colony PCR suivi d’une digestion de restriction distingue rapidement le type sauvage des séquences éditées. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de vérifier pour plusieurs copies du guide ARN clonés en PV1524. Car cela permettra de réduire l’efficacité de l’édition du génome.
N’oubliez pas, C.Albicans est un agent pathogène BL2, et à toujours où approprié tenue de laboratoire et de suivre toutes les procédures de sécurité tout en effectuant cette procédure.
