Questo metodo può aiutare a rivelare le differenze tra funghi e mammiferi a livello molecolare. Tali differenze possono essere sfruttate per identificare nuovi approcci terapeutici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che modifica in modo più efficiente il genoma dei C.Albicans rispetto alle classiche tecniche di ricombinazione omologha.
Per identificare la sequenza di RNA guida identificare una sequenza PAM NGG vicino a dove verrà inserito il codone di arresto. Qui sono mostrate tutte le sequenze PAM trovate nelle prime 100 coppie di basi di TPK2, una subunità catalitica ciclica AMP chinasi. Identificare il primer guida in avanti in tre sequenze.
Questa sequenza sarà di 20 basi direttamente a monte di un sito PAM NGG e non conterrà più di cinque T di fila. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla base direttamente a monte dell'NGG e trascinare il cursore 20 basi. Quindi, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda del primer per aggiungere il primer.
Ora, identifica il primer guida inversa tre sequenze, che sarà il complimento per la sequenza di guida in avanti. Leccare a sinistra sulla base direttamente a monte dell'NGG e trascinare il cursore 20 basi. Per ogni primer, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda del primer per aggiungere il primer.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sul primer e selezionare copia dati primer. Incollare le sequenze in un programma di modifica del testo. Aggiungere sequenze di sporgenza per inoltrare e invertire gli oligo guida per facilitare la clonazione.
Aggiungere la sequenza nucleotidica ATTTG alle cinque estremità principali del primer guida avanti tre e aggiungere G alle tre estremità principali del primer guida avanti tre. Infine, alla sequenza nucleotidica AAAAC alle cinque estremità prime del primer guida inversa tre e aggiungere C alle tre estremità principali del primer guida inversa tre prima dell'acquisto. Test di colorante il vettore di espressione cas9 ottimizzato Candida aggiungendo pv1524, 10x buffer, bs9b1 e acqua a 50 micro litri in un tubo da 1,5 millilitri e incubare a 55 gradi Celsius per 20 minuti.
Raffreddare la miscela di digestione a temperatura ambiente e girare per 30 secondi a 2348 volte G per portare la condensa sul fondo del tubo. Per trattare la fosfatasi la spina dorsale digerita, aggiungere un microlitro di Fosfatasi intestinale del vitello alla miscela di digestione. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora prima.
Ora, fosforilato e anneal forward guide primer tre e reverse guide primer tre, combinandoli con 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase e acqua in un tubo PCR. Aggiungere 10x T4 Ligase Buffer, T4 Polynucleotide Kinase e Molecular Biology Grade Water a un secondo tubo PCR come controllo negativo. Incubare le miscele di reazione in un termociclo a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi a 95 gradi Celsius per 5 minuti.
Raffreddare la miscela alla velocità di rampa più lenta a 16 gradi Celsius per ricottura degli oligi. Quindi incubare la miscela di oligo ricotto a 4 gradi Celsius. Ora ligate gli oligiti ricotti in PV1524 digeriti.
Nel primo tubo PCR, aggiungere 10x T4 Ligase Buffer, t4 DNA Ligasi, miscela di oligo ricotto, plasmide purificato trattato con CIP digerito e acqua a un volume totale di 10 microliter. Allo stesso modo preparare un secondo tubo PCR utilizzando la miscela di controllo negativo invece della miscela di oligo ricotto. Incubare entrambi i tubi in un termociclo a 16 gradi Celsius per 30 minuti, quindi a 65 gradi Celsius per 10 minuti e infine raffreddare a 25 gradi Celsius.
Dopo la legatura, trasformare le miscele di legatura in cellule chimicamente competenti e quindi purificare e sequenziare i plasmidi come descritto nel protocollo di testo. Per progettare il modello di riparazione, inserire un codone di arresto facendo clic a sinistra nella sequenza genica e aggiungendo nucleotidi che codificano un codone di arresto e un sito di digestione delle restrizioni. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse su 10 basi a valle di dove verrà effettuata la mutazione e trascinare il cursore 60 basi a monte.
Leccare a sinistra sulla scheda del primer per aggiungere il primer. In questo modo il modello di ripristino verrà aggiunto tre. Quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse su 10 basi a monte di dove verrà effettuata la mutazione e trascinare il cursore 60 basi a valle.
Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sulla scheda del primer per aggiungere il primer. In questo modo il modello di ripristino ne invertirà tre. Per generare il modello di riparazione, aggiungere il primer forward template di riparazione, il primer inverso del modello di riparazione, i trifosfati deossinucleotidi, il buffer, la polimerasi TACH e l'acqua a ciascuno dei quattro tubi PCR.
Ora esegui l'estensione del primer eseguendo da 20 a 30 cicli di PCR. Per digerire i plasmidi correttamente clonati, aggiungere plasmide, tampone 10x, albumina sierica bovina, KPN 1, SAC 1 e acqua a 40 microlitri volume totale in un tubo da 1,5 millilitri. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte.
Nel frattempo, coltiva una cultura notturna di C.albicans SC5314, prototrofia di tipo selvaggio, a 25 gradi Celsius in uridina integrata YPD. Far crescere la coltura a una densità ottica a 600 nanometri o OD 600 inferiore a sei. Pellet cinque OD 600 unità di celle per trasformazione filando per cinque minuti a 2348 volte G.Quindi sospendere le celle pelletate in 100 microlitri di TE/Acetato di litio.
Ora, a un tubo da 1,5 millilitri e in ordine, aggiungere le cellule ri-sospese, il DNA dello sperma di salmone bollito e raffreddato rapidamente, la digestione del plasma, il modello di riparazione purificato e il buffer di piastre. Preparare un controllo negativo nello stesso modo, tranne per sostituire l'acqua ad un volume uguale a quello del DNA trasformante. Dopo aver incubato le trasformazioni durante la notte, riscaldare le cellule posizionandole in un bagno d'acqua di 44 gradi Celsius per 25 minuti.
Girare per cinque minuti a 2348 volte G in una centrifuga da banco e rimuovere la miscela di piastre supernatante. Lavare una volta aggiungendo un millilitro di Uridine Integrato YPD e centrifugare di nuovo. Dopo aver sospeso le cellule in 0,1 millilitro di Uridine Integrato YPD, incubare la sospensione su un tamburo a rulli o shaker a 25 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo, placcare le cellule su Uridine Integrato YPD con 200 microgrammi per millilitro di nourseothricin. Le colonie appariranno tra due o cinque giorni e dovrebbero essere striate per singole colonie come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire la PCR colonia, progettare un primer di controllo in avanti di circa 200 coppie di basi lungo il flusso del sito di restrizione che è stato introdotto, così come un primer inverso circa 300 coppie di basi a valle.
Aggiungere 0,3 microlitri di primer a controllo avanti, 0,3 microlitri di primer a controllo inverso, 0,3 microlitri di polimerasi termostabile, tre microlitri di dNTP, tre microlitri di tampone XTAC e 23 microlitri di acqua a un tubo. Quindi aggiungere 0,25 microlitri di una singola colonia di lievito alla miscela usando una punta della pipetta P10 e facendo attenzione a non disturbare l'ager. Dopo aver amplificato il DNA tramite PCR, eseguire cinque microlitri della PCR sul gel per garantire il successo dell'amplificazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet di detriti cellulari nella parte inferiore del tubo.
I risultati rappresentativi per l'editing del genoma mediato CRISPR in C.Albicans sono mostrati qui. C.Albicans è stato trasformato con RNA guida e modelli di riparazione che prendono di mira C.Albicans TPK2. Un sito di digestione delle restrizioni EcoR1 e fermare i codoni nel modello di riparazione interrompono il sito PAM e facilitano lo screening per i mutanti corretti.
La PCR colonia seguita dalla digestione delle restrizioni distingue rapidamente il tipo selvaggio dalle sequenze modificate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare la presenza di più copie delle RNA guida clonate in PV1524. In quanto ciò ridurre l'efficienza di editing del genoma.
Non dimenticare che C.Albicans è un agente patogeno BL2, e di indossare sempre, se del caso, l'abbigliamento da laboratorio e seguire tutte le procedure di sicurezza durante l'esecuzione di questa procedura.
