这种方法可以帮助揭示真菌和哺乳动物在分子水平上的差异。可以利用这种差异来确定新的治疗方法。与经典的同源重组技术比较，该技术的主要优点是它更有效地修改了C.Albicans的基因组。
要识别引导RNA序列，请确定靠近停止codon插入位置的NGG PAM序列。此处显示，所有 PAM 序列都位于 TPK2 的第 100 个碱基对中，这是一个循环 AMP 激酶催化亚单位。确定前导底三个序列。
此序列将是 NGG PAM 站点直接上游的 20 个基座，并且连续包含不超过 5 个 T。左键单击 NGG 正上游的基座，然后拖动光标 20 基。然后，左键单击底图选项卡以添加底图。
现在，确定反向导轨底像三个序列，这将是对前进导序的赞美。左舔 NGG 正上游的底座，拖动光标 20 底座。对于每个底图，左键单击底图选项卡以添加底项符。
右键单击底图并选择复制底图数据。将序列粘贴到文本编辑程序中。将悬伸序列添加到前进和反向引导寡头，以方便克隆。
将核苷酸序列 ATTTG 添加到前进导序底转三的五个底端，并将 G 添加到前进导轨底转三的三个底端。最后，在核苷酸序列AAAAC到反向导序底图三的五个底端，并在购买前将C添加到反向导序底图三的三个底端。染料测试念珠子优化的cas9表达向量，在1.5毫升管中添加pv1524、10x缓冲液、bs9b1和水到50微升，并在55摄氏度下孵育20分钟。
将消化混合物冷却至室温，在 2348 倍 G 下旋转 30 秒，使冷凝到管底。要磷酸酶治疗消化的骨干，在消化混合物中加入一微升的小牛肠磷酸酶。在37摄氏度前孵育反应一小时。
现在，磷酸盐和退火前导导底片三和反向导导底片三，将它们与10x T4利加塞缓冲液，T4多核苷酸激酶，和水在PCR管中结合。将10x T4利加塞缓冲液、T4多核苷酸激酶和分子生物学级水加入第二个PCR管作为负对。在37摄氏度的热循环器中孵育反应混合物30分钟，然后在95摄氏度下孵育5分钟。
将混合物在最慢的斜坡速率冷却至16摄氏度，使寡头退火。然后在4摄氏度下孵育退火的寡性混合物。现在将退火的寡头放入消化的 PV1524 中。
在第一个PCR管中，加入10x T4利加塞缓冲液、t4 DNA Ligase、退火寡糖混合物、消化CIP处理纯化质粒和水到10微升总体积。同样，使用负控制混合物而不是退火的寡分混合物准备第二个 PCR 管。在16摄氏度的热循环器中孵育两根管子30分钟，然后在65摄氏度下孵育10分钟，最后冷却至25摄氏度。
结扎后，将结扎混合物转化为化学上称职的细胞，然后按照文本协议中所述对质粒进行纯化和测序。要设计修复模板，请通过左键单击基因序列中插入停止胶合体，并添加编码停止胶合物并限制消化位点的核苷酸。左键单击将发生突变的下游 10 个基座，并将光标 60 基在上游拖动。
左舔底像标签添加底像。这将添加将修复模板转发三。然后左键单击将发生突变的上游 10 个碱基，并将光标 60 基在下游拖动。
左键单击底图选项卡以添加底图。这将添加修复模板反向三。要生成修复模板，请将修复模板向前底材、修复模板反向底材、脱氧核苷酸三磷酸盐、缓冲液、TACH 聚合酶和水添加到四个 PCR 管中。
现在，通过运行 20 到 30 轮 PCR 来执行底流扩展。要消化正确克隆的质粒，在1.5毫升管中加入质粒、10倍缓冲液、牛血清白蛋白、KPN 1、SAC 1和水到40微升总体积。一夜之间在37摄氏度下孵育。
同时，在25摄氏度的尿素补充YPD的C.albicansSC5314，野生型原生，生长一个过夜文化。在 600 纳米或小于 6 的 OD 600 下将培养成光密度。每个转化的5个OD 600单位细胞，以2348倍G的速度旋转5分钟，然后悬浮在100微升TE/醋酸锂微升中。
现在，到1.5毫升管和顺序，加入重新悬浮的细胞，煮沸和快速冷却的鲑鱼精子DNA，血浆消化，纯化修复模板，和板缓冲液。以相同的方式准备负对，但以等于转化DNA的体积替代水。孵育一夜后，加热将细胞放入44摄氏度的水浴中25分钟。
在台式离心机中旋转 2348 次 G，旋转五分钟，然后取出板混合物上一代。通过添加一毫升的乌里丁补充YPD并再次离心洗一次。在将 0.1 毫升的 Uridine 补充 YPD 中细胞悬浮后，在 25 摄氏度的滚筒或摇床上孵育悬浮液。
第二天，在Uridine补充YPD上的细胞与200微克每毫升的努尔西诺他林。殖民地将在两到五天内出现，并且应该像文本协议中描述的单一殖民地一样条纹。要执行殖民地 PCR，请设计一个正向检查底像，大约 200 个基对向上引入的限制站点流，以及一个反向底像约 300 基对下游。
添加 0.3 微升的前检查底板、0.3 微升的反向检查底板、0.3 微升的热固性聚合酶、3 微升的 dNTP、3 微升的 XTAC 缓冲液和 23 微升的水到管中。然后使用P10移液器尖端将单个酵母菌群的0.25微升加入混合物中，并注意不要打扰啤酒。通过 PCR 放大 DNA 后，在凝胶上运行五微升 PCR，以确保放大成功，注意不要干扰管底的细胞碎片颗粒。
此处显示了CRISPR中筛选的C.Albicans基因组编辑的代表性结果。C.Albicans 使用针对 C.Albicans TPK2 的指南 RNA 和修复模板进行转换。EcoR1 限制消化站点并停止修复模板中的鳕鱼会破坏 PAM 站点，并方便筛选正确的突变体。
殖民地PCR后，限制消化迅速区分野生类型与编辑序列。在尝试此过程时，必须记住检查克隆到 PV1524 的指南 RNA 的多个副本。因为这将降低基因组编辑效率。
别忘了，C.Albicans 是 BL2 病原体，在执行此程序时，请始终穿着适当的实验室服装并遵循所有安全程序。
