사인 방사선 사진은 표적에 대한 특정 방사선 리간드를 사용하여 조직에서 단백질 결합 부위의 분포를 연구하는 강력하고 간단한 기술입니다. 또한 면역 히스토케화학에 적합한 대안입니다. 이 기술은 전통적인 필름 노출보다 빠른 디지털 이미지를 통해 공간 해상도로 단백질 발현을 시각화합니다.
그것은 또한 단백질 표적의 약리 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 유리에 장착 된 마우스 조직을 포함하지만 다른 종또는 커버립에서 자란 세포로 확장 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 Nane Griem-Krey가 할 것입니다.
시작하려면, 그것을 동결 스냅 가루 드라이 아이스에 조직을 잠급. 냉동 조직을 영하 20도로 설정된 냉동 조직을 냉동으로 직접 옮기습니다. 조직이 20 분 동안 극저온에서 영하 20도까지 적응하게하십시오.
그런 다음 조직 홀더를 극저온 외부의 중간체로 덮고 냉동 조직 표본을 원하는 방향으로 빠르게 배치하고 중간크기는 여전히 액체입니다. 조직 홀더를 다시 극저온으로 옮기고 경화시 영하 10도 이하의 온도에 내장 된 매체를 노출하십시오. 극저온의 마이크로토메에 티슈 홀더를 배치합니다.
기울어질 부분을 피하기 위해 조직의 방향을 조정합니다. 원하는 두께의 섹션에서 스테레오 탁스 아틀라스의 지도로 조직을 잘라 필요한 경우 작은 브러시로 섹션을 펼칩니다. 해동은 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트합니다.
그런 다음 원하는 기술 반복에 대한 관심 영역에서 섹션을 순차적으로 수집합니다. 슬라이드의 섹션이 추가 처리 전에 1시간 동안 공기를 건조하게 합니다. 인증된 방사능 실험실에서 연필을 사용하여 슬라이드에 실험 조건과 라벨을 부착합니다.
슬라이드를 플라스틱 트레이에 수평으로 놓습니다. 문제의 대상에 맞게 조정된 적절한 양의 SA 버퍼를 슬라이드에 장착된 섹션에 신중하게 적용합니다. 각 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
비특이적 결합의 판정을 위해 라벨이 없는 화합물의 관련 농도로 SA 버퍼를 보충하십시오. 그런 다음 증발을 피하기 위해 트레이를 뚜껑으로 덮습니다. 20 rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 30분 동안 관련 온도에서 사전 배양합니다.
다음으로 각 슬라이드에서 인큐베이션 전 액체를 부어 슬라이드를 플라스틱 트레이로 다시 옮습니다. 즉시 SA 버퍼에서 radioligand의 관련 농도와 함께 섹션을 완전히 덮습니다. 비특이적 결합의 판정을 위해, 라벨이 없는 화합물의 관련 농도로 radioligand 용액을 보충한다.
트레이를 뚜껑으로 덮고 원하는 조건에서 20 rpm에서 일정한 부드러운 흔들림으로 인큐베이션하십시오. 그 후 인큐베이션 용액을 부어 슬라이드를 현미경 슬라이드 랙으로 옮킨다. 슬라이드를 즉시 씻으십시오.
GHB 프로토콜의 경우 얼음 차가운 SA 버퍼로 20초 간 세척한 다음 슬라이드 랙을 얼음 차가운 증류수로 채워진 트레이에 찍어 두 번 헹구십시오. 슬라이드를 랙에 수직으로 배치하고 공기건조를 최소 1시간 동안 건조시합니다. 그런 다음 실온에서 하룻밤 고정을 위해 파라포름알데히드를 포함하는 고정소로 슬라이드를 옮김합니다.
다음 날, 실온에서 실리카 젤이 들어있는 건조기 상자로 슬라이드를 옮기. 수분을 제거하기 위해 3 시간 동안 건조기 상자에 슬라이드를 둡니다. 첫째, 조직을 향하고 방사선 차폐 이미징 플레이트 카세트에 섹션을 배치합니다.
방사성 리간드 결합의 후속 정량화를 위해 모든 카세트에 방사성 마이크로 스케일을 포함한다. 사용 직전에 삼중수소에 민감한 인광 화상 진찰 판을 인광 화상 진찰 기계에 적재하고 제조업체의 지시에 따라 가시적외선에 노출하여 지웁니까. 그런 다음 인광 화상 진찰 기계에서 이미징 플레이트를 제거하고 즉시 카세트의 섹션에 놓습니다.
카세트가 완전히 닫혀 있는지 확인합니다. 빛으로부터 보호하면서 실온에서 최적화된 노출 시간을 위해 피광기 이미징 플레이트에 섹션을 노출시하십시오. 노출 후, 조심스럽게 어둠 속에서 카세트를 열고 즉시 인광구 이미저의 어두운 상자에 이미징 플레이트를 전송합니다.
디지털 이미지를 얻기 위해 가능한 최고 해상도로 플레이트를 스캔합니다. 먼저 적절한 이미지 분석 프로그램을 엽니다. 메뉴 항목 영역 측정을 선택하여 각 교정 표준에 대한 상대 광학 밀도를 결정합니다.
지역 생성을 위한 도구를 선택하고 방사성 마이크로스케일의 각 지점에 대해 동일한 크기의 영역을 선택하는 데 사용합니다. 메뉴 항목 레이블 아래의 번호를 클릭하여 선택한 각 영역에 숫자를 할당합니다. 파일 내보내기를 클릭한 다음 2D 지역 보고서를 클릭하여 교정 표준의 각 지점에 대한 OD 값을 내보냅니다.
독점 이미징 소프트웨어에서 영역 생성 도구를 사용하여 모든 섹션에 대한 관심 영역을 선택하고 OD를 측정하여 자동 라디오그램의 정량화를 수행합니다. 관심 영역에 대한 템플릿을 만들어 모든 섹션에서 동일한 영역을 선택하고 각 자동 라디오그램의 뇌 해부학의 사소한 변형으로 복사하여 조정합니다. 이 후 파일 내보내기 2D 지역 보고서를 클릭하여 선택한 영역의 ROD 값과 크기를 스프레드시트로 내보냅니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 radioligand의 바인딩을 결정합니다. 이 연구에서는, 높은 친화성 GHB 결합 부위의 해부학적 분포는 관상, 처탈 및 수평 섹션으로 절단된 마우스 뇌에서 방사성 표지된 GHB 아날로그 방사성 HOCPCA로 시각화됩니다. 높은 수준의 결합은 해마와 피질에서 볼 수 있으며, 낮은 결합 수준은 줄무늬에서 볼 수 있으며 소뇌에서 바인딩이 감지되지 않습니다.
여기에 도시된 바와 같이, 해부학적 구조는 상이한 평면을 사용하여 시각화될 수 있고 해부학적 무결성은 크레실 바이올렛 스테인링에 의해 지원될 수 있다. 쥐, 마우스 및 돼지의 대표적인 자동 방사선 사진은 포유류 뇌에서 높은 친화성 GHB 결합 부위의 진화적 보존을 보여줍니다. 방사성 HOCPCA 결합 부위는 그들 사이의 총 뇌 해부학의 비교를 가능하게 하는 모든 3종에서 검출됩니다.
높은 선호도 GHB 바인딩 사이트는 바인딩 사이트에 대한 서로 다른 친화성을 표시하지만 유사한 특정 활동을 표시하는 GHB radioligands와 프로브됩니다. 방사성 HOCPCA는 고감도 및 뛰어난 신호 대 잡음 비율을 부여합니다. 방사성 NCS-382의 낮은 감도로 인해 유사한 수준의 결합을 얻기 위해 더 높은 방사성 리간드 농도를 사용해야 합니다.
방사성 GHB가 유사한 결합 수준을 달성하기 위해서는 더 높은 방사성 GHB가 필요합니다. 그러나, 더 높은 radioligand 농도는 또한 노이즈 비율에 결과적으로 더 낮은 신호와 비특이적 결합의 수준을 증가시다. 소음 비에 가장 좋은 신호를 얻기 위해 radioligand 농도, 세척 및 노출 시간과 같은 분석 조건을 최적화하는 것이 중요하며 이전에 플레이트를 지우는 것도 매우 중요합니다.
절차는 발견 프로젝트에 유용 할 수있는 살아있는 동물의 화합물 바인딩에 대한 아이디어를 얻기 위해 생체 내 조건으로 확장 될 수있다. 인증된 완전한 방사성 물질이 있는 실험실에서 일하고 방사능 또는 파라포름알데히드를 취급할 때 보호복을 착용해야 합니다.
