Autoradiographie ist eine leistungsstarke und einfache Technik, um die Verteilung von Proteinbindungsstellen in Geweben mit spezifischen Radioligand für das Ziel zu untersuchen. Es ist auch eine geeignete Alternative zur Immunhistochemie. Diese Technik visualisiert den Proteinausdruck mit räumlicher Auflösung über digitale Bilder, die schneller als herkömmliche Filmbelichtung ist.
Es kann auch für die pharmakologische Analyse von Protein-Targets verwendet werden. Die Methode umfasst Mausgewebe, die auf Glas montiert sind, kann aber auf andere Arten oder sogar auf Zellen ausgedehnt werden, die auf Deckellipsen angebaut werden. Die Demonstration des Verfahrens wird von Nane Griem-Krey, einer Doktorandin in meinem Labor, sein.
Um zu beginnen, tauchen Sie das Gewebe in pulverisiertes Trockeneis, um es zu fangen einfrieren. Übertragen Sie das gefrorene Gewebe direkt in einen Kryostat, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist. Lassen Sie das Gewebe auf minus 20 Grad Celsius im Kryostat für 20 Minuten akklimatisieren.
Dann bedecken Sie den Gewebehalter mit einbettendem Medium außerhalb des Kryostats und legen Sie die gefrorene Gewebeprobe schnell in die gewünschte Ausrichtung, während das Einbettmedium noch flüssig ist. Den Gewebehalter zurück in den Kryostat geben und das Einbettmedium Temperaturen unter minus 10 Grad Celsius zur Verhärtung aussetzen. Positionieren Sie den Gewebehalter im Mikrotom des Kryostats.
Passen Sie die Ausrichtung des Gewebes an, um geneigte Abschnitte zu vermeiden. Schneiden Sie das Gewebe unter Anleitung eines stereotaxic Atlas in Abschnitten der gewünschten Dicke und entfalten Sie den Abschnitt mit einem kleinen Pinsel, wenn nötig. Tauen Sie den Abschnitt auf einem Mikroskopschlitten montieren.
Dann sammeln Sie sequenziell die Abschnitte aus dem Interessengebiet für die gewünschte technische Wiederholung. Lassen Sie die Abschnitte auf den Dias eine Stunde lang trocknen, bevor Sie weiterhand finden. Verwenden Sie in einem zertifizierten Radioaktivitätslabor einen Bleistift, um die Dias mit den experimentellen Bedingungen zu kennzeichnen.
Platzieren Sie die Dias horizontal in Kunststoffschalen. Wenden Sie sorgfältig ein entsprechendes Volumen des sA-Puffers an, der an das betreffende Ziel angepasst ist, auf die auf den Folien montierten Abschnitte an. Stellen Sie sicher, dass jeder Abschnitt vollständig abgedeckt ist.
Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung, ergänzen SA Puffer mit einer relevanten Konzentration von unbeschrifteten Verbindung. Dann bedecken Sie die Schalen mit Deckeln, um Verdunstung zu vermeiden. Vorinkubieren bei einer relevanten Temperatur für 30 Minuten auf einem Plattenschütter auf 20 Rpm eingestellt.
Als nächstes gießen Sie die Vorinkubationsflüssigkeit aus jedem Dia ab und übertragen Sie die Dias wieder in die Kunststoffschale. Die Abschnitte sofort vollständig mit der entsprechenden Konzentration von Radioligand im SA-Puffer abdecken. Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung, ergänzen Radioligand-Lösung mit einer relevanten Konzentration von unbeschrifteter Verbindung.
Bedecken Sie die Schalen mit Deckeln und brüten Unter den gewünschten Bedingungen mit konstantem sanftem Schütteln bei 20 U/min. Danach die Inkubationslösung abgießen und die Dias in ein Mikroskop-Dia-Rack übertragen. Waschen Sie die Dias sofort.
Für das GHB-Protokoll zweimal mit eiskaltem SA-Puffer für 20 Sekunden waschen und dann zweimal abspülen, indem Sie das Schieberegal in Schalen tauchen, die mit eiskaltem destilliertem Wasser gefüllt sind. Positionieren Sie die Schlitten vertikal in Dengestellen und trocknen Sie sie mindestens eine Stunde lang. Dann übertragen Sie die Dias auf einen Fixator, der Paraformaldehyd zur nächtlichen Fixierung bei Raumtemperatur enthält.
Übertragen Sie die Dias am nächsten Tag in eine Trockenbaubox mit Kieselgel bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Dias in der Trockenzisator-Box für drei Stunden, um Feuchtigkeit zu beseitigen. Legen Sie die Abschnitte zunächst in eine strahlungsabgeschirmte Bildkassette mit nach oben gerichtetem Gewebe.
Fügen Sie eine radioaktive Mikroskala in jede Kassette für die nachfolgende Quantifizierung der Radioligand-Bindung ein. Laden Sie die tritiumempfindliche Phosphor-Bildgebungsplatte unmittelbar vor dem Einsatz in die Phosphor-Bildgebungsmaschine und setzen Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers sichtbarem Infrarotlicht aus, um sie zu löschen. Entfernen Sie dann die Bildplatte von der Phosphor-Bildgebungsmaschine und legen Sie sie sofort auf die Abschnitte in der Kassette.
Stellen Sie sicher, dass die Kassette vollständig geschlossen ist. Setzen Sie die Abschnitte der Phosphor-Bildgebungsplatte für die optimierte Belichtungszeit bei Raumtemperatur aus, während sie vor Licht geschützt ist. Nach der Belichtung die Kassette im Dunkeln vorsichtig öffnen und die Bildplatte sofort in die dunkle Box eines Phosphor-Imagers übertragen.
Scannen Sie die Platte mit der höchstmöglichen Auflösung, um ein digitales Bild zu erhalten. Öffnen Sie zunächst ein entsprechendes Bildanalyseprogramm. Bestimmen Sie die relativen optischen Dichten für jeden Kalibrierungsstandard, indem Sie die Bestimmung des Menüpunktbereichs auswählen.
Wählen Sie das Werkzeug für die Regionserstellung aus, und verwenden Sie es, um einen Bereich gleicher Größe für jeden Punkt der radioaktiven Mikroskala auszuwählen. Weisen Sie jedem ausgewählten Bereich eine Nummer zu, indem Sie auf die Nummer unter der Menüelementbeschriftung klicken. Klicken Sie auf Dateiexport und dann auf 2D-Regionsbericht, um die OD-Werte für jeden Punkt des Kalibrierungsstandards zu exportieren.
Verwenden Sie in der proprietären Imaging-Software ein Regionserstellungstool, um den Bereich auszuwählen, der für jeden Abschnitt von Interesse ist, und messen Sie seine ODs, um mit der Quantifizierung der Autoradiogramme zu beginnen. Wählen Sie in jedem Abschnitt den gleichen Bereich aus, indem Sie eine Vorlage für den Interessenbereich erstellen und kopieren und an kleinere Variationen der Gehirnanatomie in jedem Autoradiogramm anpassen. Klicken Sie anschließend auf Dateiexport-2D-Regionsbericht, um die ROD-Werte und -Größen ausgewählter Bereiche in eine Kalkulationstabelle zu exportieren.
Bestimmen Sie die Bindung des Radioligands, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird die anatomische Verteilung der hochaffinen GHB-Bindungsstellen mit dem radioaktiv markierten GHB analogen radioaktiven HOCPCA in einem Maushirn visualisiert, das in koronale, sagittale und horizontale Abschnitte geschnitten wurde. Hohe Bindungsraten sind im Hippocampus und Kortex zu beobachten, während niedrigere Bindungswerte im Striatum beobachtet werden und keine Bindung im Kleinhirn nachgewiesen wird.
Wie hier gezeigt, können die anatomischen Strukturen mit verschiedenen Ebenen visualisiert werden und die anatomische Integrität kann durch kresylviolette Färbung unterstützt werden. Repräsentative Autoradiogramme einer Ratte, einer Maus und eines Schweins veranschaulichen die evolutionäre Erhaltung der hohen Affinitäts-GHB-Bindungsstellen im Säugetierhirn. Radioaktive HOCPCA-Bindungsstellen werden bei allen drei Arten nachgewiesen, die einen Vergleich der groben Hirnanatomie zwischen ihnen ermöglichen.
Die hochaffinen GHB-Bindungsstellen werden mit GHB-Radioliganden untersucht, die unterschiedliche Affinitäten für die Bindungsstellen, aber vergleichbare spezifische Aktivitäten aufweisen. Radioaktives HOCPCA ist mit einer hohen Empfindlichkeit und einem ausgezeichneten Signal-Rausch-Verhältnis ausgestattet. Aufgrund der geringeren Empfindlichkeit des radioaktiven NCS-382 müssen höhere Radioligaandkonzentrationen verwendet werden, um ähnliche Bindungswerte zu erhalten.
Noch höhere Radioligaand-Konzentrationen sind notwendig, damit radioaktive SGH B vergleichbare Bindungswerte erreichen können. Höhere Radioligand-Konzentrationen erhöhen jedoch auch den Grad der unspezifischen Bindung mit einem folglich niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis. Es ist wichtig, die Assay-Bedingungen wie die Radioligand-Konzentration, Wasch- und Belichtungszeit zu optimieren, um die besten Signal-Rausch-Verhältnisse zu erhalten, und es ist auch sehr wichtig, sich daran zu erinnern, die Platte vorher zu löschen.
Das Verfahren kann auf in vivo-Bedingungen ausgedehnt werden, um eine Vorstellung von der Verbindungsbindung in einem lebenden Tier zu bekommen, die für Entdeckungsprojekte nützlich sein könnte. Denken Sie daran, in einem Labor mit zertifiziertem vollradioaktivem Material zu arbeiten und Schutzkleidung beim Umgang mit Radioaktivität oder Paraformaldehyd zu tragen.
