La autoradiografía es una técnica potente y sencilla para estudiar la distribución de sitios de unión a proteínas en tejidos utilizando radioligand específica para el objetivo. También es una alternativa adecuada a la inmunohistoquímica. Esta técnica visualiza la expresión proteica con resolución espacial a través de imágenes digitales que es más rápida que la exposición a la película tradicional.
También se puede utilizar para el análisis farmacológico de dianas proteicas. El método consiste en tejidos de ratón montados en vidrio, pero pueden extenderse a otras especies o incluso a células cultivadas en cubreobjetos. Demostrar el procedimiento será de Nane Griem-Krey, estudiante de doctorado en mi laboratorio.
Para empezar, sumerja el tejido en hielo seco en polvo para congelarlo a presión. Transfiera el tejido congelado directamente a un criostato que esté ajustado a menos 20 grados Celsius. Deje que el tejido se aclimate a menos 20 grados Celsius en el criostato durante 20 minutos.
A continuación, cubra el soporte de tejido con un medio de incrustación fuera del criostato y coloque rápidamente la muestra de tejido congelado en la orientación deseada mientras el medio de incrustación sigue siendo líquido. Transfiera el soporte de tejido de vuelta al criostato y exponga el medio de incrustación a temperaturas inferiores a menos 10 grados Celsius para el endurecimiento. Coloque el soporte de tejido en el microtoma del criostato.
Ajuste la orientación del tejido para evitar secciones inclinadas. Cortar el tejido con la guía de un atlas estereotaxico en secciones del espesor deseado y desplegar la sección con un pequeño cepillo si es necesario. Descongelar montar la sección en una diapositiva del microscopio.
A continuación, recopile secuencialmente las secciones de la región de interés para la repetición técnica deseada. Deje que las secciones de los portaobjetos se sequen al aire durante una hora antes de su posterior manipulación. En un laboratorio de radiactividad certificado, utilice un lápiz para etiquetar los portaobjetos con las condiciones experimentales.
Coloque las diapositivas horizontalmente en bandejas de plástico. Aplique cuidadosamente un volumen adecuado de búfer SA ajustado al objetivo en cuestión a las secciones montadas en las diapositivas. Asegúrese de que cada sección esté completamente cubierta.
Para la determinación de la unión no específica, suplemento SA buffer con una concentración relevante de compuesto sin etiquetar. A continuación, cubra las bandejas con tapas para evitar la evaporación. Pre-incubar a una temperatura relevante durante 30 minutos en una coctelera de placa ajustada a 20 rpm.
A continuación, vierta el líquido de pre-incubación de cada diapositiva y transfiera los portaobjetos de nuevo a la bandeja de plástico. Cubra inmediatamente las secciones completamente con la concentración relevante de radioligand en el búfer SA. Para la determinación de la unión no específica, suplemento de radioligand solución con una concentración relevante de compuesto sin etiquetar.
Cubra las bandejas con tapas e incubar en las condiciones deseadas con un agitado suave y constante a 20 rpm. Después de esto, vierta la solución de incubación y transfiera las diapositivas a un portaobjetos del microscopio. Lave inmediatamente los portaobjetos.
Para el protocolo GHB, lave dos veces con el tampón SA helado durante 20 segundos y luego enjuague dos veces sumergiendo el portaobjetos en bandejas llenas de agua destilada helada. Coloque las diapositivas verticalmente en bastidores y seque al aire durante al menos una hora. A continuación, transfiera las diapositivas a un fijador que contenga paraformaldehído para una fijación durante la noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, transfiera los portaobjetos a una caja desecadora que contenga gel de sílice a temperatura ambiente. Deje los portaobjetos en la caja del desecador durante tres horas para eliminar la humedad. En primer lugar, coloque las secciones en un casete de placa de imágenes protegido por radiación con el tejido hacia arriba.
Incluya una microescala radiactiva en cada casete para la posterior cuantificación de la unión por radioligand. Inmediatamente antes de su uso, cargue la placa de imágenes de fósforo sensible al tritio en la máquina de imágenes de fósforo y expongala a la luz infrarroja visible de acuerdo con las instrucciones del fabricante para borrarla. A continuación, retire la placa de imágenes de la máquina de imágenes de fósforo e tírela inmediatamente en las secciones del cassette.
Asegúrese de que el cassette esté completamente cerrado. Exponga las secciones a la placa de imágenes de fósforo para optimizar el tiempo de exposición a temperatura ambiente mientras está protegido de la luz. Después de la exposición, abra cuidadosamente el cassette en la oscuridad e inmediatamente transfiera la placa de imagen a la caja oscura de un imager de fósforo.
Escanee la placa con la resolución más alta posible para obtener una imagen digital. Para empezar, abra un programa de análisis de imágenes adecuado. Determine las densidades ópticas relativas para cada estándar de calibración seleccionando la determinación de la región de elemento de menú.
Seleccione la herramienta para la creación de regiones y utilícela para seleccionar un área de igual tamaño para cada punto de la microescala radiactiva. Asigne un número a cada área seleccionada haciendo clic en el número debajo de la etiqueta del elemento de menú. Haga clic en Exportación de archivos y, a continuación, en Informe de región 2D para exportar los valores de OD para cada punto del estándar de calibración.
En el software de imágenes patentado, utilice una herramienta de creación de regiones para seleccionar la región de interés en cada sección y medir sus ODs para comenzar a realizar la cuantificación de los autoradiogramas. Seleccione la misma región en cada sección creando una plantilla para la región de interés y cópiela y ajústela a pequeñas variaciones en la anatomía cerebral en cada autoradiograma. Después de esto, haga clic en Informe de región 2D de exportación de archivos para exportar los valores y tamaños de ROD de las áreas seleccionadas a una hoja de cálculo.
Determine el enlace de la radioligand como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la distribución anatómica de los sitios de unión GHB de alta afinidad se visualiza con el ACAC radiactivo analógico GHB radiomarcado en un cerebro de ratón que se cortó en secciones coronales, sagitales y horizontales. Altos niveles de unión se observan en el hipocampo y la corteza, mientras que los niveles de unión más bajos se observan en el estriado y no se detecta ninguna unión en el cerebelo.
Como se muestra aquí, las estructuras anatómicas se pueden visualizar utilizando diferentes planos y la integridad anatómica puede estar apoyada por la tinción violeta de cresil. Los autoradiogramas representativos de una rata, un ratón y un cerdo ilustran la conservación evolutiva de los sitios de unión GHB de alta afinidad en el cerebro de los mamíferos. Los sitios de unión a HOCPCA radiactivos se detectan en las tres especies, lo que permite comparar la anatomía cerebral bruta entre ellas.
Los sitios de enlace GHB de alta afinidad se sondean con radioligandes GHB que muestran diferentes afinidades para los sitios de enlace, pero actividades específicas comparables. El HOCPCA radiactivo está dotado de una alta sensibilidad y una excelente relación señal-ruido. Debido a la menor sensibilidad del NCS-382 radioactivo, se deben utilizar concentraciones de radioligand más altas para obtener niveles similares de unión.
Las concentraciones de radioligy aún más altas son necesarias para que la GHB radiactiva alcance niveles de unión comparables. Sin embargo, las concentraciones de radioligy más altas también aumentan el nivel de unión no específica con una relación señal-ruido consecuentemente más baja. Es importante optimizar las condiciones del ensayo como la concentración de radioligand, el lavado y el tiempo de exposición con el fin de obtener la mejor relación señal-ruido y también es muy importante recordar borrar la placa antes.
El procedimiento se puede extender a condiciones in vivo para tener una idea sobre la unión de compuestos en un animal vivo que podría ser útil para proyectos de descubrimiento. Recuerde trabajar en un laboratorio con material radiactivo completo certificado y usar ropa protectora al manipular la radiactividad o el paraformaldehído.
