オートラジオグラフィーは、標的に対して特定の放射線リガンドを使用して組織中のタンパク質結合部位の分布を研究するための強力で簡単な技術です。免疫検査に代わるのにも適しています。この技術は、従来のフィルム露出よりも高速なデジタル画像を介して空間分解能を用いてタンパク質発現を可視化する。
また、タンパク質標的の薬理学的分析に使用してもよい。この方法は、ガラスに取り付けられたマウス組織を含むが、他の種に拡張されるか、あるいはカバースリップで増殖した細胞に拡張することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ナネ・グレム=クレイです。
まず、粉末ドライアイスに組織を沈め、凍結します。凍結した組織を、マイナス20度に設定されたクライオスタットに直接移します。凍結スタットで20分マイナス20度に組織を順応させます。
次に、凍結スタットの外側に埋め込み培地で組織ホルダーを覆い、埋め込み培地がまだ液体である間、すぐに凍結した組織標本を所望の方向に置きます。組織ホルダーをクライオスタットに戻し、埋め込み培地をマイナス10°C以下の温度に曝して硬化させます。凍結スタットのミクロトームに組織ホルダーを置きます。
傾斜した切片を避けるために、組織の向きを調整します。所望の厚さのセクションで立体性アトラスの指導で組織を切断し、必要に応じて小さなブラシでセクションを展開します。顕微鏡のスライドにセクションを取り付けます。
次に、目的の技術的な繰り返しのために、関心のある領域からセクションを順次収集します。スライドのセクションを1時間空気乾燥させてから、さらに処理します。認定された放射能研究所では、鉛筆を使用してスライドに実験条件のラベルを付けます。
スライドをプラスチックトレイに水平に配置します。対象に合わせて適切な SA バッファをスライドに取り付けたセクションに慎重に適用します。各セクションが完全にカバーされていることを確認します。
非特異的結合の決定のために、非標識化合物の関連濃度でSAバッファーを補う。その後、蒸発を避けるために蓋でトレイを覆います。20rpmにセットされたプレートシェーカーで30分間、関連温度で予熱する。
次に、各スライドからプレインキュベーション液を注ぎ、スライドをプラスチックトレイに戻します。直ちにSAバッファー内の放射性リガンドの関連濃度でセクションを完全にカバーします。非特異的結合の決定のために、非標識化合物の関連濃度で放射性リガンド溶液を補う。
蓋でトレイを覆い、20 rpmで一定の穏やかな揺れで所望の条件下でインキュベートします。この後、インキュベーション溶液を注ぎ、スライドを顕微鏡スライドラックに移します。すぐにスライドを洗ってください。
GHBプロトコルの場合、氷冷SAバッファーで20秒間洗浄し、スライドラックを氷冷蒸留水で満たされたトレイに浸して2回洗い流します。スライドをラックに垂直に配置し、空気乾燥を少なくとも 1 時間は使用します。次に、パラホルムアルデヒドを含む固定剤にスライドを移し、室温で一晩固定します。
翌日、スライドを室温でシリカゲルを含むデシケータボックスに移します。水分を除去するために、デシケーターボックスにスライドを3時間放置します。まず、切片を、組織を上に向けた放射線遮蔽イメージングプレートカセットに入れる。
放射性リガンと結合の後の定量のためにすべてのカセットに放射性マイクロスケールを含める。使用直前に、トリチウム感受性蛍光体イメージングプレートを蛍光イメージングマシンにロードし、メーカーの指示に従って可視赤外線に露出して消去します。次に、蛍光体イメージングマシンからイメージングプレートを取り出し、すぐにカセット内のセクションに置きます。
カセットが完全に閉じられていることを確認します。光から遮光しながら室温での最適な露光時間のために、このセクションを蛍光イメージングプレートに露出させます。露光後、暗い中でカセットを慎重に開け、すぐに蛍光体の画像装置の暗い箱に画像板を移します。
デジタル画像を得るために可能な限り最高の解像度でプレートをスキャンします。まず、適切な画像解析プログラムを開きます。メニュー項目領域決定を選択して、キャリブレーション規格ごとの相対的な光学密度を決定します。
領域作成用のツールを選択し、それを使用して、放射性マイクロスケールの各ポイントに等しいサイズの領域を選択します。メニュー項目のラベルの下の番号をクリックして、選択した各領域に番号を割り当てます。[ファイルエクスポート]、[2D リージョン レポート]の順にクリックして、キャリブレーション規格の各ポイントの OD 値をエクスポートします。
独自のイメージングソフトウェアでは、領域作成ツールを使用して、すべてのセクションで対象領域を選択し、そのODを測定してオートラジオグラムの定量化を開始します。各セクションで、対象領域のテンプレートを作成してコピーし、各オートラジオグラムの脳の解剖学の小さなバリエーションに合わせて調整することで、同じ領域を選択します。その後、[ファイル エクスポート 2D 領域レポート] をクリックして、選択した領域の ROD 値とサイズをスプレッドシートにエクスポートします。
テキストプロトコルで概説されているように、ラジオリガンドの結合を決定します。本研究では、高親和性GHB結合部位の解剖学的分布を、コロナ、矢状、および水平切片に切断したマウス脳の放射標識GHBアナログ放射性HOCPCAで可視化する。海馬と皮質では高レベルの結合が見られ、線条体では低い結合レベルが見られ、小脳では結合は検出されない。
ここに示すように、解剖学的構造は異なる平面を用いて視覚化され、解剖学的完全性はクレシルバイオレット染色によって支持され得る。ラット、マウスおよびブタの代表的なオートラジオグラムは、哺乳類の脳における高親和性GHB結合部位の進化的保全を示す。放射性HOCPCA結合部位は、それら間の総脳解剖学の比較を可能にする3種すべてで検出される。
高親和性GHB結合部位は、結合部位に対して異なる親和性を示すが、同等の特定の活動を示すGHB放射リガンドで調査される。放射性HOCPCAは高感度で、ノイズ比に優れた信号を与えられる。放射性NCS-382の感度が低いため、同様のレベルの結合を得るためには、より高い放射性リガンド濃度を使用する必要があります。
放射性GHBが同等の結合レベルを達成するには、さらに高い放射性リガンド濃度が必要です。しかし、高い放射性リガンド濃度はまた、結果的に低い信号対雑音比で非特異的結合のレベルを増加させる。放射リガンド濃度、洗浄、暴露時間などのアッセイ条件を最適化して、ノイズ比に対する最良の信号を得ることが重要であり、プレートを以前に消去することも非常に重要です。
この手順は、発見プロジェクトに役立つ可能性のある生きている動物の化合物結合に関するアイデアを得るためにin vivo条件に拡張することができます。放射線活性やパラホルムアルデヒドを扱う際には、認定された完全な放射性物質を持つ実験室で働き、防護服を着用することを忘れないでください。
