אוטוביוגרפיה היא טכניקה חזקה ופשוטה ללמוד הפצה של אתרי קשירה חלבון ברקמות באמצעות radioligand ספציפי עבור היעד. זה גם חלופה מתאימה אימונוהיסטוכימיה. טכניקה זו מדמיינת ביטוי חלבון ברזולוציה מרחבית באמצעות תמונות דיגיטליות מהירות יותר מחשיפה מסורתית לסרטים.
זה עשוי לשמש גם לניתוח תרופתי של מטרות חלבון. השיטה כוללת רקמות עכבר המותקנות על זכוכית אך ניתן להרחיבן למינים אחרים או אפילו לתאים הגדלים על כיסויים. הדגמת ההליך תהיה על ידי נאן Griem-Krey, דוקטורנט במעבדה שלי.
כדי להתחיל, להטביע את הרקמה באבקת קרח יבש כדי לצלם להקפיא אותו. מעבירים את הרקמה הקפואה ישירות להקפאה שנקבעה למינוס 20 מעלות צלזיוס. תן לרקמה להתאקלם למינוס 20 מעלות צלזיוס בהקפאה במשך 20 דקות.
לאחר מכן מכסים את מחזיק הרקמה עם מדיום הטבעה מחוץ קריוסטט במהירות למקם את דגימת הרקמה הקפואה בכיוון הרצוי בעוד המדיום הטבעה הוא עדיין נוזלי. מעבירים את מחזיק הרקמה בחזרה להקפאטאט וחושפים את המדיום המטביע לטמפרטורות מתחת למינוס 10 מעלות צלזיוס להקשחה. מקם את מחזיק הרקמה במיקרוטום של ההקפאה.
התאימו את כיוון הרקמה כדי למנוע מקטעים משופעים. חותכים את הרקמה עם הדרכה של אטלס סטריאוטוקסי בחלקים של עובי הרצוי ולפתח את החלק עם מברשת קטנה במידת הצורך. הפשר את המקטע על מגלשת מיקרוסקופ.
לאחר מכן לאסוף ברצף את הסעיפים מאזור העניין עבור החזרה הטכנית הרצויה. אפשר לחלקים בשקופיות להתייבש למשך שעה אחת לפני טיפול נוסף. במעבדה רדיואקטיבית מוסמכת, השתמש בעיפרון כדי לתייג את השקופיות בתנאי הניסוי.
מקם את השקופיות אופקית במגשי פלסטיק. החל בזהירות אמצעי אחסון מתאים של מאגר שיוך דם המותאם ליעד הנדון על המקטעים שנטענו בשקופיות. ודא שכל מקטע מכוסה לחלוטין.
לקביעת איגוד לא ספציפי, תוספת מאגר SA עם ריכוז רלוונטי של תרכובת ללא תריס. לאחר מכן מכסים את המגשים במכסים כדי למנוע אידוי. טרום דגירה בטמפרטורה רלוונטית במשך 30 דקות על שייקר צלחת להגדיר 20 סל"ד.
לאחר מכן, יוצקים את נוזל הדגירה מראש מכל שקופית ומעבירים את השקופיות בחזרה למגש הפלסטיק. מיד לכסות את החלקים לחלוטין עם הריכוז הרלוונטי של radioligand במאגר SA. לקביעת מחייב לא ספציפי, תוספת רדיוליגנד פתרון עם ריכוז רלוונטי של תרכובת ללא תריס.
מכסים את המגשים במכסים ודגירה בתנאים הרצויים עם רעידות עדינות קבועות ב-20 סל"ד. לאחר מכן, יוצקים את פתרון הדגירה ומעבירים את השקופיות לתוך ארון תקשורת לשקופיות מיקרוסקופ. מיד לשטוף את השקופיות.
לפרוטוקול GHB, יש לשטוף פעמיים עם חיץ SA קר כקרח למשך 20 שניות ולאחר מכן לשטוף פעמיים על-ידי טבילת מתלה השקופיות במגשים מלאים במים מזוקקים קרים כקרח. מקם את השקופיות אנכית בארונות תקשורת וייבש את האוויר למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן להעביר את השקופיות ל קיבוע המכיל paraformaldehyde עבור קיבעון לילה בטמפרטורת החדר.
למחרת, להעביר את המגלשות לקופסת desiccator המכילה ג'ל סיליקה בטמפרטורת החדר. השאירו את השקופיות בתיבת ההתבולל למשך שלוש שעות כדי למנוע לחות. ראשית, מניחים את החלקים לתוך קלטת צלחת הדמיה מוגנת קרינה עם הרקמה פונה כלפי מעלה.
כלול מיקרו-קנה מידה רדיואקטיבי בכל קלטת לכמות הבא של כריכת רדיוליגנד. מיד לפני השימוש, לטעון את צלחת הדמיה זרחן רגיש טריטיום לתוך מכונת הדמיה זרחן ולחשוף אותו לאור אינפרא אדום גלוי על פי הוראות היצרן כדי למחוק אותו. לאחר מכן הסר את לוח ההדמיה ממכונת ההדמיה של הזרחן והצב אותה מיד על החלקים בקלטת.
ודא שהקלטת סגורה לחלוטין. חשוף את החלקים לצלחת הדמיית הזרחן לזמן החשיפה האופטימי בטמפרטורת החדר תוך שמירה מפני אור. לאחר החשיפה, פותחים בזהירות את הקלטת בחושך ומיד מעבירים את לוח ההדמיה לתוך הקופסה הכהה של דימוי זרחן.
סרוק את הלוח ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית כדי לקבל תמונה דיגיטלית. כדי להתחיל, פתח תוכנית מתאימה לניתוח תמונות. קבע את הצפיפות האופטית היחסית עבור כל תקן כיול על-ידי בחירת קביעת אזור פריט התפריט.
בחרו בכלי ליצירת אזורים ולהשתמש בו לבחירת אזור בגודל שווה לכל נקודה במיקרו-גוונים הרדיואקטיביים. הקצה מספר לכל אזור שנבחר על-ידי לחיצה על מספר תחת תווית פריט התפריט. לחץ על ייצוא קבצים ולאחר מכן על דוח אזור דו-מימדי כדי לייצא את ערכי ה- OD עבור כל נקודה בתקן הכיול.
בתוכנת ההדמיה הקניינית, השתמש בכלי ליצירת אזור כדי לבחור את אזור העניין בכל מקטע ולמדוד את ה- ODs שלו כדי להתחיל לבצע כימות של האוטרדיוגרמות. בחר את אותו אזור בכל מקטע על-ידי יצירת תבנית עבור אזור העניין והעתק והתאם אותו לווריאציות קלות באנטומיה של המוח בכל אוטורדוגרמה. לאחר מכן, לחץ על דוח אזור דו-מימדי של ייצוא קבצים כדי לייצא את הערכים והגדלים של ROD של אזורים נבחרים לגיליון אלקטרוני.
קבע את האיגוד של הרדיוליגנד כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, ההתפלגות האנטומית של אתרי קשירה GHB זיקה גבוהה הם דמיינו עם רדיולאבלד GHB אנלוגי רדיואקטיבי HOCPCA במוח העכבר אשר נחתך לתוך קורונדל, קשת, וקטעים אופקיים. רמות גבוהות של קשירה נראים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח, בעוד רמות קשירה נמוכות יותר נראים בסטריאטום ולא מזוהה כריכה בצוואר הקטן.
כפי שמוצג כאן, המבנים האנטומיים עשויים להיות חזותיים באמצעות מישורים שונים ושלמות אנטומית עשויה להיות נתמכת על ידי כתמים סגולים cresyl. אוטורדוגרמות מייצגות של חולדה, עכבר וחזיר ממחישות את השימור האבולוציוני של אתרי קשירה GHB בעלי זיקה גבוהה במוח היונקים. אתרי איגוד HOCPCA רדיואקטיביים מזוהים בכל שלושת המינים המאפשרים השוואה של אנטומיה מוחית גסה ביניהם.
אתרי איגוד GHB זיקה גבוהה נבדקים עם רדיוליגנדים GHB אשר מציגים זיקה שונה עבור אתרי הכריכה אבל פעילויות ספציפיות דומות. HOCPCA רדיואקטיבי ניחן ברגישות גבוהה ויחס אות מעולה לרעש. בשל הרגישות הנמוכה יותר של NCS-382 רדיואקטיבי, יש להשתמש בריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר על מנת להשיג רמות דומות של קשירה.
אפילו ריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר נחוצים עבור GHB רדיואקטיבי כדי להשיג רמות קשירה דומות. עם זאת, ריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר גם להגדיל את רמת כריכה לא ספציפית עם יחס אות נמוך יותר לרעש וכתוצאה מכך. חשוב לייעל את תנאי ההתמדה כמו ריכוז radioligand, כביסה ותזמן חשיפה על מנת לקבל את האות הטוב ביותר ליחסי רעש וזה גם מאוד חשוב לזכור למחוק את הצלחת לפני.
ניתן להאריך את ההליך לתנאי vivo כדי לקבל מושג על כריכה מורכבת בבעלי חיים אשר יכול להיות שימושי עבור פרויקטים גילוי. זכור לעבוד במעבדה עם חומר רדיואקטיבי מלא מוסמך ללבוש בגדים מגן בעת טיפול רדיואקטיביות או paraformaldehyde.
